间充质干细胞深低温保藏技术体系的建立与初步分析

朱志浩，高家明，沈君颜，祝建波，刘海亮,*

(1 新疆植物药资源利用教育部重点实验室/石河子大学生命科学学院，新疆 石河子 832003； 2 同济大学医学院/附属东方医院再生医学研究所，上海 200123)

间充质干细胞的组织来源骨髓基质细胞最初在骨髓基质中被发现后，间充质干细胞已经从几个成人和胎儿组织中分离和鉴定，包括脂肪，真皮(皮肤)，滑膜液，骨膜，脐带血，胎盘和羊水。脂肪间充质干细胞的发现给生命科学带来划时代的改变，充分利用脂肪间充质干细胞的分化潜能在临床医学应用，治愈重大疾病，如脑血栓、心肌梗死、糖尿病等。它可以分化成这些坏死的细胞，进入这些器官，行使和死亡细胞一样的功能，彻底治愈这类疾[1-4]。并且它也可以分化成这些器官的年轻细胞，替代器官内衰老的细胞，将分化后的年轻细胞植入该器官并成活后，进而替代功能衰竭或者损毁的器官，如肾损伤，肝坏死，心脏的衰竭，从而延缓衰老。

干细胞冻存是研究干细胞生物学功能的重要方法之一，冻存剂的选择起到了关键性的作用。目前细胞冻存剂主要有两种类型：一种是渗透性保护剂包括：甘油、二甲基亚砜(DMSO)、乙二醇(EG)、丙二醇(PG)、甘油(GLY)。其原理属低分子中性物质，易与溶液中水分子结合，易于穿透细胞；另一种是非渗透性保护剂：聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖、白蛋白等。其原理属大分子物质，不能穿透细胞；在冰晶形成之前，优先结合溶液中水分子；降低细胞外溶液的电解质浓度，减少阳离子进入细胞的数量。已有较多研究对多种冻存剂进行了分析，虽然DMSO在毒性方面要大于EG，PG，GLY，但是其冻存效果仍然较好。DMSO与PVP冻存效果相似。近年来，相对于传统的冻存剂(DMSO，GLY，Tre)，左旋肉碱(L-carnitine)、海藻糖(Trehalose)也显示出比较好的冻存效果，在细胞毒性方面，也显示出较大的优势[5-8]。

目前，在干细胞广泛研究和应用的基础上，建立临床级间充质干细胞标准制备工艺技术和干细胞库就显得尤为重要。临床级干细胞，就再生医学而言，可以随时投入临床使用的干细胞，即可用于人类的临床研究，制备标准严格，具有“临床级”质量，不需要昂贵而又危险的转换过程。临床级干细胞的提供途径消除了基于细胞的疗法发展的重大障碍，而且临床级干细胞的分离与扩增是干细胞产业化过程中的重要环节。标准化，产业化的干细胞生产，这意味着每批细胞都符合临床使用所需的质量和安全标准。标准化能更快地为患者提供救生疗法[9-12]。因此，开发标准性干细胞分离纯化和保藏的新技术是进一步推动干细胞临床应用的必然趋势。从而更能实现干细胞治疗产品生产的标准化、规模化运行，质量达到临床应用标准。经过综合分析，本研究重点分析DMSO、 L-carnitine和Trehalose这3种冻存剂冻存脂肪间充质干细胞的效果与能力。

1 材料与方法

1.1 材料

DMEM/F12(Thermo)，NEAA (non-essential amino acids)，胎牛血清(FBS)，0.25% 胰蛋白酶-EDTA(Sigma公司)，海藻糖(上海国药)，肉毒碱(美国AMRESCO公司)，地塞米松(Sigma公司)，维生素C(Sigma 公司)，硫代甘油(Sigma 公司)，成骨诱导分化培养基(CYAGEN)，CCK-8试剂，油红O染液，脂肪干细胞，神经干细胞，293细胞。

细胞培养箱(Heraeus)，超净工作台(Forma Scientific Inc)，倒置显微镜(OLYMPUS公司)，光学显微镜(OLYMPUS公司)，低温离心机(Heraeus仪器公司)，-80 ℃冰箱(Forma Scientific 公司)，液氮罐，流式细胞仪(美国Beckmen Coulter 公司)，酶标仪。细胞培养瓶(美国Corning)：T25，T75；细胞培养板(美国 Corning)：6，12，24孔；细胞培养皿：10 cm2；移液管(美国Forma)：5 mL，10 mL；离心管：15 mL；冻存管：1.8 mL；酶标板：平底96孔透明酶标板。

1.2 细胞冻存

配制各种细胞冻存液。取对数生长期的细胞，去除旧培养基，用PBS清洗。去除PBS，加入适量胰蛋白酶(覆盖培养皿表面)把单层生长的细胞消化下来。1 500 r·min-1，离心5 min。去除胰蛋白酶，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打混匀，计数，调节冻存液中细胞的最终密度[13-15]。一般为5×106或1×107个·mL-1。将细胞分装于冻存管中，每管1 mL。在冻存管管中标明细胞的名称，冻存时间及操作者。也可将冻存管放入4 ℃，2h，-80 ℃，过夜，放入液氮中。

1.3 细胞复苏

从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37 ℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。从37 ℃水浴锅中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上培养液，混匀。离心，1 500 r·min-1，离心5 min。弃去上清，加入新鲜培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度，接种于培养瓶中，37 ℃培养箱静置培养。

1.4 间充质干细胞活性检测

细胞活力测定，对冻存1、3、7 d的ADSC，在复苏后24 h和48 h进行细胞活性检测，分析不同冻存剂冻存时间长短和复苏后不同时间的细胞活性。CCK-8检测步骤。向各孔中加入100 μL细胞悬液，向各孔中加入各浓度的待测溶液10 μL，在37 ℃下孵育培养板。向各孔中加入10 μL的CCK-8溶液，37 ℃孵育1～4 h，测定450 nm处的OD值。

1.5 细胞周期检测

收集复苏后的特定传代ADSC细胞，细胞个数为1×106个。离心弃上清，加入300 μL预冷的PBS制成单细胞悬液。加入700 μL预冷的无水乙醇固定，-20 ℃放置待测。上机检测前加入PBS稀释细胞，离心弃上清，加入终浓度500 μg·mL-1的。RnaseA置于37 ℃孵育30 min。加入终浓度50 μg/mL的碘化丙啶，4 ℃避光孵育30 min。流式细胞仪检测细胞DNA含量，软件分析。

1.6 成骨诱导

取特定代次生长良好的ADSC细胞，胰酶消化，1×105个·mL-1的浓度接种于6孔板，用完全培养基培养24 h后，更换成骨诱导培养基。每3天换一次液，以未加诱导培养基的细胞培养孔作空白对照，共诱导培养基28 d。诱导期间用倒置显微镜观察细胞形态的变化，并拍照记录。取成骨诱导培养基诱导14 d和28 d后的细胞进行茜素红染色。

1.7 RNA提取及RNA-seq分析

使用TRIzol(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)从冻存前和冻存后的ADSC细胞中提取总RNA，并用NanoDrop 1000(Thermo Fisher Scientific)进行定量。将符合质量标准(260/280 nm> 1.8)的样品进行后续实验。测序数据分析均基于高质量的数据，使用Bowtie v2.0.6(bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2)软件构建参考基因组的索引，并使用TopHat v2.0.9(ccb.jhu.edu/software/tophat)软件将配对末端的干净读数与参考基因组对齐。基于基因长度和映射到该基因的读数计数，并考虑测序深度和基因长度对读数计数的影响，计算出每千个转录本的读数，每个基因的百万个图谱读数(RPKM)。差异基因通过权重基因共表达网络分析(WGCNA)计算，画图[16-18]。

1.8 统计分析

通过单因素方差分析确定，*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001。

2 结果与分析

2.1 细胞活性检测

本实验采用3种冻存剂，六组实验；1号，5% DMSO+10% FBS；2号，5% DMSO；3号，5% Trehalose+10%FBS；4号，5% Trehalose；5号，5% L-carnitine+10% FBS；6号，5% L-carnitine；分别冻存ADSC，实验中发现，4号和6号冻存ADSC后，细胞死亡率很大，无法进行后续实验，因此后续实验只对1号，2号，3号和5号进行。在ADSC冻存1、3、7 d后复苏。培养24 h后，检测细胞活性。

结果如图1所示：1号实验组细胞活性最高，在冻存1、3、7 d复苏后，其均值分别为0.413 3、0.265 5和0.218 4，随着冻存时间的增加呈现出逐渐下降趋势；2号实验组在冻存1、3、7 d复苏后其细胞活性均值分别为0.152 9、0.201 6和0.283 1，并随时间表现出逐渐上升的趋势；在3号实验组中，细胞冻存1 d和3 d后细胞活性并没有表现出很大差别，而在冻存7 d复苏后细胞活性略有上升；5号实验组中，细胞活性虽时间表现出先上升后下降的趋势，在冻存1 d复苏后，其细胞活性为0.153 9，冻存3 d复苏后，细胞活性为0.167 7，冻存7 d后为0.148 7。

总体变化不大。复苏后培养48 h细胞活性与24 h具有相似的特点(图1)。

以上结果表明，1号实验组在细胞冻存复苏24 h后具有最高活性，说明1号实验组为该实验条件下的最佳冻存剂组合。与1号实验组相比，2号实验组ADSC细胞在冻存1 d和3 d，复苏后其活性显著的低于1号实验组。当冻存时间延长至7 d时，2号实验组的细胞活性显著上升且明显高于1号实验组，这一现象表明在进行长时间的冻存时，FBS可能会对细胞活性产生一定的影响。

从实验结果中不难发现，在细胞冻存过程中，FBS在对细胞活性的保护中起到了关键性作用。FBS是细胞培养中用量最大的天然培养基，含有丰富的细胞生长必须的营养成分。提供结合蛋白，能识别维生素，脂类，金属和其他激素等，能结合或调变他们所结合的物质活力。但其具体的影响机制仍需进行进一步的探究。

3号实验组和5号实验组与1号实验组相比，其细胞活性要明显低于1号实验组。这一实验结果表明，DMSO在细胞冻存过程中对细胞活性的影响要略低于Trehalos和L-carnitine，DMSO更适合作为ADSC细胞冻存剂在实验中使用。综上，5%DMSO+10%FBS为当前实验条件下最适的冻存剂组合。在同样的低温，DMSO条件下，FBS对维持ADSC存活起到了关键性作用。

2.2 细胞周期检测

当冻存剂组合1号为5% DMSO+10% FBS时，对冻存1、3、7 d后复苏的ADSC进行流式细胞分析，结果如图2所示，G1期细胞所占比例由冻存1 d的79.85%，到3 d的 75.74%,再到7 d的89.88%。G1含量呈现先下降后上升的趋势。

S期，1 d，11.15%,3 d，17.24%，7 d，3.35%。随冻存天数的增加，S期总体呈现先上升后下降的趋势。当冻存剂为2号5% DMSO时，对冻存1、3、及7 d后复苏的ADSC进行流式细胞分析，结果如图2所示，G1期细胞所占比例，1 d，65.78%，3 d，66. 15%，7 d，89.94%。G1期细胞所占比例，随冻存天数增加，呈上升趋势。S期细胞所占比例，1 d，27.38%，3 d，26.34%，7 d，2.9%,S期含量呈下降。

以上结果表明，DMSO试剂对细胞有保护作用，低温抑制细胞的生长与分化。综上，1号实验组与2号实验组相比，尤其是冻存1 d和3d后，S期，1号数据小于2号。分别为10.58%和18.87%。

说明在有FBS情况下，冻存1～3 d，确实影响了ADSC细胞的增值效率。但是冻存7 d后，几乎没有差别。

图2 不同冻存剂冻存ADSC 1、3、 7 d复苏后细胞周期检测

当冻存剂为5% Trehalos+10% FBS，对冻存1、3、7 d后复苏的ADSC进行流式分析(图3)。在冻存1、3、7 d后，G1含量分别为80.73%，85.58%，93.15%。随冻存天数的增加，G1含量总体呈上升趋势。在冻存1、3、7 d后，S期含量分别为9.93%，11.85%，2.17%。随冻存天数的增加，S期含量呈现先上升后下降趋势。当冻存剂为5% L-carnitine+10% FBS时。冻存1、3、7 d后复苏，流式细胞分析结果见图4。冻存1、3、7 d后，G1含量分别为91.55%，78.54%，88.57%。随冻存天数的增加，G1含量总体呈下降趋势(图4)。在冻存1、3、7 d后，S期含量分别为5.09%，17.74%，3%。随冻存天数的增加，S期含量呈现先上升后下降趋势。

从细胞周期来看，短期(1 d～3 d冻存)，不同冻存剂确实可以引起细胞周期的改变，尤其是对于细胞增殖来说，但是如果冻存时间较长(如7 d)就会大大缩小这个差距，冻存剂之间差别不明显。并且我们可以看到，冻存剂中包含FBS一定程度上会影响ADSC的增殖(图2)。

2.3 成骨诱导分析

为了进一步验证冻存是否会对ADSC的分化潜能有影响，我们进一步选择1号和2号冻存剂进行ADSC成骨分化，分别冻存1 d和5d后复苏进行成骨诱导。

从诱导的颜色来看，红色较深，诱导成骨效果较好。1号冻存剂，冻存1 d后，复苏细胞诱导成骨细胞较多，出现大量红色聚集斑块。冻存5 d后，诱导成骨细胞也较多，两者效果差别不明显(图3A、3B)。而使用2号冻存剂，可以明显看到，不管是冻存1 d还是5 d，成骨分化的效果较1号冻存剂诱导效果要弱(图3C、3D)。因此，在同样的低温，DMSO条件下，FBS对维持ADSC的分化潜能起到非常关键的作用。

A：1号冻存剂，冻存ADSC 1 d 成骨分化；B：1号冻存剂， 冻存ADSC 5 d成骨分化；C：2号冻存剂，冻存ADSC 1 d成骨分化； D：2号冻存剂，冻存ADSC 5 d成骨分化；成骨分化图片(50 μm)。图3 1号和2号冻存剂冻存ADSC1d和5 d后复苏， 诱导成骨分化检测

2.4 RNA-seq表达谱分析

为了验证冻存剂在冻存过程中对细胞内基因表达的影响，我们又选择以1号冻存剂：5% DMSO+10% FBS，分别对冻存前和冻存后的ADSC细胞进行了RNA-seq表达谱结合生物信息WGCNA分析，结果表明，在冻存过程中，冻存剂的存在会对细胞的整体表达谱会产生一定的影响(图4)。但是这个影响是因为冻存产生的还是因为冻存剂的影响产生的，还需要进一步实验验证。

总之，这在一定程度上说明，如果是要通过表达谱确定ADSC的相关参数，一定要选取相同条件的细胞，更为可靠的最好是复苏后培养一段时间再进行检测。

ME：Module Eigengenes (基因簇特征向量矩阵)，纵向不同颜色 代表不同的共表达基因簇。图4 RNA-seq表达谱分析1号冻存剂冻存 ADSC前后基因表达水平

2.4.1 样品间维恩图分析

冻存前有811个特异性表达基因，而冻存后有590个特异性表达基因，两者共有基因数目为15 287(图5)。共有基因数目远远高于冻存前后的特异性基因数目，说明细胞冻存虽然对脂肪干细胞的整体活性具有一定的影响，然而这种影响相对比较小。

图5 样品间维恩图分析

2.4.2 DEG层次聚类分析

根据各个样品基因表达水平，我们检测样品之间的差异表达基因(DEG)，使用 DEseq2和 PossionDis 方法进行差异检测。根据需求，我们对 DEG 进行层次聚类 (图6)。该图直观地反映了差异基因上下调的聚类情况，同时适用于不同差异方案间DEG差异倍数的比较。

X轴代表进行聚类分析的差异比对，Y轴代表差异基因。 颜色代表log2转换过的差异倍数， (颜色越红代表上调倍数越大，越蓝代表下调倍数越大)。图6 DEG层次聚类热图

2.4.3 差异表达基因GO功能分析

通过GO富集性分析，低温冻存对细胞代谢和调控影响最大 (图7)。整体上，细胞冻存过程对脂肪干细胞的代谢和信号调控过程影响较大。

X轴代表DEG数目，Y轴代表GO功能分类图7 差异基因GO功能分类图

3 讨论

科学家们开始意识到了许多重大疾病或特殊生物学现象的发生机制都可以从干细胞角度从新认识，这意味着临床上的许多疾病的防止研究可以从干细胞的角度进行，也意味着一些新的防止方法和手段的产生。本实验从不同冻存剂冻存应用更加广泛的ADSC细胞后，对其细胞增殖，细胞周期，成骨分化潜能以及基因表达谱的研究，从一定角度了解了ADSC细胞对于不同冻存剂冻存的反应，为后面详细而细致的研究奠定了基础[19-20]。

细胞活性检测结果表明：对照组细胞在冻存后的复苏效果优于实验组，且不同冻存剂之间的冻存效果也存在一定差异。对照组(5% DMSO+10% FBS)表现出最好的冻存效果，在进行液氮冻存1、3、7 d后，其细胞在复苏24 h后的活性分别为0.413、0.267和0.218，复苏48 h后的活性分别为0.532、0.366和0.256，均高于2号(5% DMSO)、3号(5% T+10% FBS)和5号(5% L+10% FBS)实验组细胞分别在冻存复苏后的活性。细胞周期检测结果表明：在进行冻存复苏之后，处于G1期的细胞所占比例最大，处于G2期的细胞所占比例最小。在对处于S期的细胞进行进一步分析后发现，在对细胞进行短期冻存后(1～3 d)，2号实验组中处于S期细胞所占比例最大，分别为27.38%和26.34%，显著的高于对照组11.15%和17.24%。当冻存时间延长至7 d后，对照组中处于S期的细胞所占比对最大，为3.35%，5号实验组与对照组效果相似，但略低于对照组，为3%。

在培养液中加入诱导液后，会把间充质干细胞能够诱导成为成骨细胞，使用油红O染液染色，诱导成为成骨细胞能够被染成红色，红色越深或者越多，表示被诱导的细胞越多。诱导最多的是冻存剂为5% DMSO+10% FBS下冻存1 d，其次是冻存剂为5% DMSO+10% FBS下冻存5 d，诱导最少的是5% L+10% FBS冻存1 d。转录组测序及生物信息学分析结果表明，在经过冻存处理之后，脂肪干细胞的基因表达谱发生变化，说明冻存处理确实会对细胞的基因表达产生影响。本实验通过检测不同冻存剂条件下细胞复苏后的生物学特性，比较了不同冻存剂对细胞活性和细胞周期的影响，并通过表达谱数据分析了5% DMSO+10% FBS冻存剂对脂肪干细胞基因表达的影响，深低温冻存确实对脂肪干细胞的基因表达差生了影响。为充分利用干细胞进行生物组织构建、细胞移植以及其他方面的研究奠定了一定的基础。

经过整体性分析，1号，5% DMSO+10% FBS，为该实验的最佳冻存剂组合。本实验虽然尝试用其它冻存剂来代替DMSO，但是在相同浓度下，它们并没有表现的比DMSO要好，并不能很好的保护ADSC细胞，因此，在本实验中出现缺少组的实验结果，是因为冻存后，细胞就已经不能存活或者存活百分比较低，不能进行后续实验，后期能否通过改变浓度或者寻找更安全，更有效的冻存剂还需要验证。