抗结核药物组合药效筛选研究进展

刘海婷 陆宇

2019年全球新发1000万例结核病患者，我国仍是结核病高负担国家之一[1]。虽然我国药物敏感结核病的治愈率达93%[2]，但在耐药结核病患者不断增多的情况下，结核病的临床治疗变得越来越复杂。为降低单药治疗对细菌耐药性产生的风险，增大临床治愈的可能性，临床迫切需要有新作用机制的抗结核药物和高效的药物组合方案来最大限度地减少细菌负荷，提高治疗效果，缩短疗程。尽管普遍认为抗结核药物组合是治疗结核病的一个潜在工具[3]，但并不是任意的药物组合都对结核病的治疗有效，这需要通过体内外筛选实验来获得具有高活性的药物组合。笔者对近年来抗结核药物组合及体内外筛选方法进行综述，以期为Ⅱb期临床新方案的选择提供参考。

一、体外筛选法

体外筛选法在抗结核药物组合的研究中极其重要，常见的有棋盘法和时间-杀伤动力学分析法。可用于评估多种不同作用机制药物组合的体外抗结核活性，为更复杂的表型研究或体内实验的后续评估提供依据[4]。

(一)棋盘法

棋盘法是一种基于肉汤培养基中药物最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)测定的方法，可以用来评估药物对细菌的抑制作用[5]，适合2种或3种药物组合的活性筛选，应用非常广泛。棋盘法包括琼脂棋盘稀释法、试管棋盘稀释法和微量棋盘稀释法，又以后者为最常见的联合药物敏感性试验方法[6]，该方法在96孔板内进行，各药物的二倍稀释液分别加入到棋盘的水平方向和垂直方向，一般取6～8个浓度梯度[7]，并设置阳性对照孔和阴性对照孔，通过观察还原(颜色从蓝色变为紫色或粉色，表示有细菌生长)或不还原(蓝色，表示由于药物的抑制而没有细菌生长)的颜色变化直观地读取细菌生长情况，进而确定联合用药中每种药物的MIC[8]。组合作用是通过计算部分抑制浓度(fractional inhibitory concentration，FIC)来确定的。目前，较为公认的FIC法是通过计算棋盘中药物阻止孔的颜色从蓝色变为紫色或者粉红色时的最低FIC值[9]。

对于二维棋盘法，FIC=(MICA+B/MICA)+(MICB+A/MICB)，其中，MICA和MICB分别表示A药和B药单独作用于结核分枝杆菌时的MIC，MICA+B和MICB+A分别表示A药和B药联合作用后，达到相同药效时对应的A药和B药的MIC。当FIC≤0.5时，两药为协同作用(定义为两药联合用药的MIC比单独用药降低4倍或更大)；当0.5

(二)时间-杀伤动力学分析法

时间-杀伤动力学分析法被认为是确定抗菌剂间药物协同作用的标准参考方法，分为静态时间杀伤法模型和动态药动学/药效学(PK/PD)模型。该方法可以通过在包含各种抗菌剂的肉汤中添加标准接种物来实现，从含有抗菌剂的肉汤中以不同的时间间隔进行传代培养，通过连续采样来量化细菌负荷随时间的变化。药物的协同作用定义为：与单一药物最好的疗效相比，联合用药作用后活菌数减少量≥2 log10菌落形成单位(CFU)/ml被认为是协同作用，1 log10 CFU/ml≤减少量≤2 log10 CFU/ml被认为是加性的，减少量≤1 log10 CFU/ml被认为是无关作用，而活菌数增加量≥2 log10 CFU/ml被认为是拮抗作用[12]。

1.静态时间杀伤法：是将细菌在含药物组合的液体培养管中进行培养，在间隔时间点从每个试管中取出一定量的液体进行菌落计数的方法。其模型是评估细菌对药物浓度随时间固定的反应，且能同时对多种药物的抗菌效果进行评估。衡量标准包括CFU计数或替代物。

2.动态PK/PD模型法：动态PK/PD模型又称中空纤维系统(hollow fibersystem，HFS)模型，是一种常用的扩散模型，于1972年由Knazek等[13]提出。因其可承受更高的细菌负荷，已成为一种动态评估药物对细菌作用的方法[14]，并被欧洲药品管理局(European Medicines Agency，EMA)鉴定为一种用于支持抗结核治疗方案选择和开发的方法[15]。该模型以不同时间间隔从外围隔室进行采样的方式，获得量化的药物浓度和细菌计数。虽然HFS模型在抗结核药物的研究中应用很广，但也具有一定的局限性，如HFS-TB不能解释药物与血浆蛋白的潜在结合，也不能在宿主的防御下或其他可能出现的复杂结节性病变的情况下解释抗菌功效[16-17]。

二、体内筛选法

经体外筛选获得的有效抗结核药物组合方案通常要在机体内进行药物组合疗效的进一步验证，通常包括动物模型法和临床试验法。

(一)动物模型法

在抗结核新药和疫苗的研发过程中，动物模型一直是其关键组成部分[18-20]。抗结核新药的研究可以在豚鼠、小鼠、兔子和非人灵长类等不同动物模型中展开，但进行药效评价的方法有所差异。例如，鼠和兔作为动物模型时，主要通过菌落计数的下降和停止治疗后没有复发来判定治疗有效[21]；而对于非人灵长类动物来说，不仅可以采用菌落计数，还可以根据氟代脱氧葡萄糖正电子发射计算机断层扫描显像技术(FDG PET-CT)的方法来判定药物的疗效[22]。但由于遗传性、安全性和伦理学的限制，近年来抗结核药物组合疗效的研究模型主要为小鼠和豚鼠模型。

小鼠是抗结核药物组合研究中最常用的动物模型，具有体积相对较小和成本较低的优点，是药物组合研究中的最佳选择。在常用的小鼠模型(如BALB/c和C57BL/6)中，结核分枝杆菌主要侵袭小鼠肺部，但仅发展为肺部炎性而非坏死性病变，与人类结核病和其他动物模型相反；而C3HeB/FeJ小鼠模型感染结核分枝杆菌后，其肺部发生病变的病理与人类接近。有研究发现，肺部病理的不同可能会影响药物的分布，从而影响药物的疗效，如Irwin等[23]在BALB/c和C3HeB/FeJ小鼠模型中检测了贝达喹啉和吡嗪酰胺单独和联合给药时的治疗反应，发现BALB/c小鼠对两种药品均表现出高度一致的治疗反应，而C3HeB/FeJ小鼠则表现出对药品敏感和不敏感的双峰反应结果。

豚鼠是结核病研究中另一个重要的动物模型。与小鼠不同，豚鼠对结核分枝杆菌具有高度的敏感性，在其感染结核分枝杆菌后会发生与人类结核病病理相似的干酪样坏死。虽然豚鼠已成为证明链霉素、异烟肼和乙胺丁醇抗结核活性的实验性化疗动物模型的较优选择，但其作为实验性化疗模型的特性仍然很差，且成本较高，仍然不是药物组合研究中的最佳选择。从临床菌株中观察到，某些新出现的临床分离株在小鼠体内的生长要好于豚鼠，因而，结核病模型的建立在小鼠中容易实现；其次，尽管豚鼠的肺部有大面积坏死病变，但它们仍能存活很长一段时间[24]，这将影响药物疗效的评估。

(二)临床试验法

临床试验法在抗结核药物组合的筛选中占据了重要的地位，许多药物组合方案经过一系列的体外抗结核活性筛选，即可作为临床前推进药物在动物体内进行药效评估。然而，任何一种体外模型和动物模型都不能真实反映药物对人体的作用，还需进行药物在人体中安全性和有效性的评估。

抗结核药物临床试验分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ期，其中Ⅰ期试验主要是评价药物的安全性；Ⅱ期试验旨在研究抗结核药物的早期杀菌活性(early bactericidal activity，EBA)。抗结核药物早期杀菌活性的测定是一种快速评估抗结核新药和药物组合有效性的方法[25-26]，通过检测患者抗结核治疗早期痰中活的结核分枝杆菌CFU的下降，来确定药物杀死涂阳肺结核患者痰中活菌的能力，通常计算治疗前14 d CFU计数的下降率[27]。但EBA的临床研究也有其局限性，既无法评估药物对休眠结核分枝杆菌的活性，也无法确定单一药物对其联合作用的相对贡献[28]。关键Ⅲ期临床试验的主要评价终点是治疗6个月后痰培养阳性患者的比例和2年随访期内复发患者的比例，其中治疗2个月后的痰培养状态(“阳性”或“阴性”)被认为是结核病终点主要疗效的潜在替代指标。

三、抗结核药物组合新方案

目前，有14种抗结核新药处于临床试验阶段，已有8种抗结核药品用于治疗药物敏感结核病，18种用于耐药结核病，还有8种用于结核分枝杆菌潜伏感染(LTBI)者的预防性治疗方案处于临床试验阶段[29]。

(一)药物敏感结核病

随着新药的开发及药物的重新使用，一些新的药物方案逐步走向临床，旨在缩短和简化药物敏感结核病的治疗方案，以提高患者依从性。

在小鼠结核病模型研究中发现含大剂量利福平的方案可明显缩短药物敏感结核病的治疗时间[30-31]，在BALB/c小鼠结核病模型中，增加利福霉素类药物的暴露，特别是用每日高剂量利福喷丁代替利福平，可以明显缩短无复发和治愈所需的治疗时间[32-34]。而在药物敏感结核病治疗的Ⅱ期临床试验(NCT00694629)中发现，较高的利福喷丁暴露与较高的杀菌活性密切相关，且目前正在进行一项确定高剂量的利福喷丁替代利福平是否可以将药物敏感结核病的治疗时间缩短至4个月的Ⅲ期临床试验(NCT02410772)。而在前期对BALB/c小鼠模型的研究中，比较了在6个月的标准抗结核方案中加入氯法齐明与6个月的标准抗结核方案的抗结核活性，发现含有氯法齐明的方案具有显著的抗结核活性，且可将治愈患者的疗程缩短2个月[35-36]。目前Ⅱ/Ⅲ期 TRUNCATE-TB研究(NCT03474198)正在评估将氯法齐明添加到一线抗结核方案中的疗效。关于优化使用经批准的药品并改进配方和药片数量的研究也在进行中。在一个多臂多阶段(multi-arm multi-stage，MAMS)试验PanACEA (NCT01785186)研究中，调查了利福平(分别为20 mg/kg和35 mg/kg)联合莫西沙星和SQ109与含10 mg/kg 利福平的标准方案对肺结核患者的疗效，发现含35 mg/kg 的利福平是安全的，且在8周培养阴转的时间短于含20 mg/kg 和10 mg/kg 利福平的方案，可能缩短结核病的治疗时间[37]。

(二)耐药结核病

目前，WHO推荐的常规耐多药结核病的治疗方案复杂、时间长(至少20个月)、费用高、耐受性差。随着人们对结核分枝杆菌耐药性认识的不断加深，人们越来越认识到重新利用药物[如利奈唑胺(Lzd)和氯法齐明]和新药[如贝达喹啉(Bdq)和德拉马尼]有着重要的作用。

近年来，出现了许多旨在解决耐多药结核病的新疗法。2016年，WHO通过的一项为期9～11个月的Bangladesh方案[38][强化期为4～6个月的卡那霉素、加替沙星、丙硫异烟胺、氯法齐明、吡嗪酰胺(PZA)、高剂量异烟肼和乙胺丁醇，巩固期为5个月的加替沙星、氯法齐明、吡嗪酰胺和乙胺丁醇]被证明对耐多药结核病患者有效。在小鼠结核病模型研究中发现含普瑞玛尼(PA-824)、莫西沙星(Mfx)和吡嗪酰胺的新方案(Pa-M-Z)具有优于当前一线R-H-Z方案(R：利福平，H：异烟肼，Z：吡嗪酰胺)的杀菌活性[39-40]，随后的一项随机对照Ⅱ期临床研究NC-002试验(NCT01498419)证实了Pa-M-Z方案的有效性，表明这种新方案的EBA不亚于标准抗结核药品[41]，之后在小鼠结核病模型中发现，将贝达喹啉和普瑞玛尼与利奈唑胺(B-Pa-L方案)或莫西沙星和吡嗪酰胺(B-Pa-M-Z方案)联合的新方案可明显缩短抗结核疗程，并在初步临床试验中取得了尽如所期的结果；且与标准方案相比，B-Pa-M-Z方案具有更好的杀菌活性，可将预防复发所需的治疗持续时间缩短2.5～3.5个月[42]。在随后的第2阶段NC-005试验(NCT02193776)中，接受B-Pa-M-Z方案治疗的吡嗪酰胺易感的耐多药结核病患者的痰培养阴转率明显快于接受标准方案治疗的药物敏感结核病患者[43]；同样，与小鼠结核病模型研究中的标准方案相比，B-Pa-L方案也具有较好的杀菌活性[44]，虽然B-Pa-L方案不能如B-Pa-M-Z方案那样快速治愈小鼠，但其具有更广的活性范围。在随后的NiX-TB试验(NCT02333799)中评估了为期6个月的贝达喹啉联合普瑞玛尼和利奈唑胺(600 mg/次，2次/d)的方案，发现无复发患者的比例达到了87%[45]。最近，一项针对耐药结核病的end TB试验(NCT03259269)评估了含贝达喹啉和德拉马尼新方案的安全性和有效性[46]。

四、总结与展望

新药物组合方案需经过体外和体内筛选才能应用于临床，而评价药物组合抗结核活性的实验方法是将其应用于临床前的前期药效筛选的一个重要手段，它不仅能实现大规模组合活性筛选的测定，还能节约大量的实验时间和成本。目前，体外抗结核药物组合药效筛选方法多种多样，但尚缺乏标准化的评价标准，仍需进一步完善。幸运的是，随着一些新技术的发展，尤其是计算机技术与数学模型的引入，为抗结核药物的药效筛选提供了新的方向。