当前我国猪伪狂犬病的流行及疫苗应用

2021-12-05李少丽胡晓凤王家福李建林尹忠良

现代畜牧兽医 2021年4期

李少丽，胡晓凤，王家福，康斌，李建林，尹忠良

（杭州佑本动物疫苗有限公司，浙江杭州310018）

1 猪伪狂犬病概述

伪狂犬病最早于1813年发生于某牛群，病牛极度瘙痒，症状与狂犬病相似，因此称为“伪狂犬病”。20 世纪70年代后，养殖产业开始密集，再加上国际贸易引起动物及副产品运输量增加的影响，伪狂犬病由牛传染给猪[1]。伪狂犬病病原为PRV，属疱疹病毒科甲疱疹病毒亚科，其毒力由多个基因协同控制，主要有编码胸苷激酶（TK）、糖蛋白gE、gD、gI 和核苷酸还原酶（RR）等，其中TK 是PRV的主要毒力基因。TK基因的失活大大地降低病毒毒力而不影响病毒在组织培养中的增殖，该基因对病毒在中枢神经系统中的复制起主要作用，而且通过基因工程手段完全缺失TK基因的疫苗毒株在临床应用中不会出现毒力返强现象。gE糖蛋白为猪伪狂犬病病毒的非必需蛋白，决定其毒力，并促进其进入中枢神经系统。gE基因的缺失可降低病毒毒力及神经组织嗜性，从而进一步提高疫苗的安全性。gG 蛋白是一种趋化因子结合蛋白，通过结合趋化因子使其不能发挥功能，导致机体不易或难以识别入侵的病毒，缺失gG基因可以迅速继发细胞免疫，产生大量的α和β干扰素[1-2]。

PRV 宿主范围广、复制周期短、高度致病性。徐志文等[3]构建的SA215 重组病毒可在Vero、BHK21、IBRS、PK15、MDBK 和CEF 细胞上增殖并产生细胞病变。陈陆等[4]将SA215 接种Vero 细胞后8 h 细胞即变圆变亮，集聚成团，24 h 约有50%细胞形成空斑，40 h 时蚀斑面积可达90%。Wang 等[5]将构建的缺失gE 基因的HN1201 株接种PK15 细胞做蚀斑纯化，疫苗灭活前抗原含量达108.67TCID50/mL。猪是PRV 的主要宿主和贮存宿主，一旦感染将终生带毒。2 周龄以内仔猪感染PRV 后100%死亡，成年猪一般呈隐性感染，怀孕母猪可出现屡配不孕、产木乃伊胎、返情率高等；公猪患病则睾丸肿胀、萎缩，失去种用能力。PRV 常在神经节形成潜伏感染。PRV 通过口鼻感染后，最初在上呼吸道的上皮细胞内发生复制，接着感染扁桃体和肺，病毒还可通过三叉神经和嗅神经末梢侵入中枢神经系统导致化脓性脑膜炎，当机体受到外界刺激时病毒被激活，向外界排毒并造成持续性感染，即使接种疫苗也无法保护携带PRV的猪，只能通过剔除潜伏感染猪才能实现猪伪狂犬的净化[6]。

2 猪伪狂犬病疫苗的应用

2011年以前使用Bartha-K61 疫苗，我国猪伪狂犬病控制得很稳定。2011年末，很多接种过Bartha K-61 疫苗的猪场暴发猪伪狂犬病。2012年1月，山东有超过8 万头以上的猪发病，表现出猪伪狂病的临床症状，患病率达50%，大多数猪在出现症状后第3 d开始死亡，怀孕70～90 d的母猪中有35%出现流产。在发病猪中分离的3 种PRV毒株gE 基因在138～140 和1472～1474 位点有2 个不连续插入[7]。An等[8]对6个省15个猪场的临床样本PCR均检测到PRV 的gE 基因，序列分析显示所有分离株属于一个相对独立的基因决定簇，也含2个氨基酸插入。在保护试验中，Bartha-k61 疫苗接种猪对SC 经典PRV 的攻击提供100%保护，但对PRV 流行毒HeN1 只有50%保护。Wang等[5]以2011年分离的PRV变异株HN201为研究对象，缺失gE基因制备灭活疫苗，免疫3周龄仔猪，免疫猪均存活，未表现出任何临床症状，而不免疫对照组猪则表现出典型的PRV呼吸系统症状和神经症状。

2.1 PRV灭活疫苗使用现状

2001年，陈焕春等[9]从湖北某猪场死亡新生仔猪脑及内脏中分离出PRV 分离株Ea 株，接种BHK-21 细胞培养制备抗原，研制成功我国第1 个全病毒油乳剂灭活疫苗。母猪多次定期免疫该疫苗后，血清PRV 中和抗体可达、1∶16～1∶32，乳汁的中和抗体可达1∶64～1∶128，仔猪哺乳后中和抗体可达1∶64[10]。另一种被批准的是gE基因缺失的HN1201-△gE株灭活疫苗。据其研发团队介绍，该疫苗对经典株（闵A 株）和变异株（HN1201 株）的攻击均可达100%保护，而Bartha-K61 免疫组对变异株的攻击只有60%保护。

2.2 PRV活疫苗使用现状

1961年，Bartha将分离的PRV野毒在鸡胚成纤维细胞上连续传代，获得了Bartha K-61（也称K-61）疫苗株。该疫苗株不仅缺失了主要毒力基因gE及能与其组成复合物的gI蛋白基因，还在US区存在其他一些缺失，是一种天然的基因缺失疫苗，确保了疫苗的安全性。1979年，哈尔滨兽医研究所将Bartha-K61 种毒引入国内成功试制弱毒疫苗，有效遏制我国PR 疫情。吴文福等[11]测定该疫苗免疫猪后的抗体消长规律，发现猪免疫后第7 d 抗体水平开始上升，35 d达高峰，高水平的免疫抗体维持时间长达2个月以上，直至免疫后365 d PRV 中和抗体效价仍可达6.8，表现出优良的免疫效果。

2003年，四川农业大学郭万柱教授团队研制出我国第一个猪伪狂犬gE/gI/TK/LacZ+基因缺失活疫苗（SA215）。用SA215 株疫苗免疫母猪所产的所有仔猪均获得高水平母源抗体，7 日龄平均效价高达28.56，随着日龄增长抗体水平呈下降趋势，到60日龄平均效价为22.56；70日龄商品猪接种后，经过近100 d育肥，其出栏率增加20.83%。陈陆等[4]将三基因缺失疫苗（SA215株）和Bartha-K61株进行免疫攻毒，第2 d起接种猪均出现发热、精神沉郁、食欲下降，第5 d 恢复正常；而未接种对照组则在攻毒后第1 d 发热、腹泻，第4～5 d死亡，攻毒后SA215比Bartha接种猪的增重受阻天数、发热期及散毒期均缩短。

猪伪狂犬活疫苗TK/gG/gE 三基因缺失疫苗株（HB-98株）是以Ea株为背景，应用分子生物学技术改造筛选的活疫苗毒株[2]。何启盖等[12]以105.0TCID50的PRV HB-98株接种新生仔猪，接种后连同对照组用鄂A 强毒攻击，试验猪未出现不良反应，而对照猪全部发病，其中3/4的仔猪死亡。受现实低温冷冻条件制约，疫苗的研发又延伸了1个新方向，2016年，猪伪狂犬病TK/gE/gI 三基因的缺失株耐热保护剂活疫苗（HB2000）获批。

实际养殖生产中不乏免疫失败的现象发生，其中1 个非常主要的因素是免疫方式。仔猪最好要采用喷鼻免疫，喷鼻免疫属于黏膜免疫，雾状疫苗在黏膜表面2 h 内可被机体吸收，保证机体吸收足量的抗原。吸收的抗原利用“提前占位”原则，提前进入三叉神经节，避免后期伪狂犬野毒的感染。

而针对近年来Bartha-K61 毒株疫苗对我国当前流行的PRV 强毒株保护不佳的问题，学者们开始着手PRV 流行毒疫苗的开发。

3 猪伪狂犬病疫苗发展趋势

无论对活疫苗还是灭活疫苗，免疫佐剂均可以刺激机体产生非特异性免疫应答，增强疫苗的免疫效果。PRV疫苗以细胞免疫为主。Lin等[13]在Ea株灭活疫苗中加入重组猪IL2，可显著提高免疫猪的中和抗体水平和CTL活性，对Ea 株强毒的攻击产生很好的免疫保护。Rooij 等[14]以BarthaK-61疫苗为基础制备PRV弱毒活疫苗和灭活疫苗，两次免疫SPF 猪并于二免后接种105PFU 的NIA3 野毒，接种BarthaK-61 活疫苗+佐剂组和BarthaK-61 活疫苗组的猪产生了高水平中和抗体及明显的淋巴细胞增殖反应（LPT），尤其是BarthaK-61活疫苗加佐剂组的LPT反应最强。相比之下，接种Bartha K-61 灭活疫苗的两组试验猪只产生了低水平的中和抗体和极弱的LPT反应，两个灭活疫苗组尽管抗体水平有显著差异，但两组免疫保护效果均较差。表明免疫保护与LPT反应强度有关，与中和抗体滴度之间缺乏相关性。

PRV 基因组庞大，具有众多非必需基因和非编码区，PRV还具有很好的免疫原性且易感动物广泛，适合作为载体表达外源基因开发多种动物疫病的多联疫苗。徐志文等[15]以PRV SA215株为载体插入HCV 的E2基因，构建重组病毒SA215（A），仔猪免后28、42 d 分别进行PRV（Fa 强毒，106PFU）和HCV（猪瘟石门系血毒1ml，105MLD）攻毒。结果重组病毒SA215（A）对于伪狂犬病与SA215活疫苗相当，对于猪瘟则介于猪瘟兔化弱毒疫苗和猪瘟睾丸细胞苗之间，显示出较好的免疫效果。Lei 等[16]以PRV 变异株为骨架，缺失gE/gI/TK基因后也插入CSFV的E2基因构建重组病毒，以PRV（TJ株）、猪瘟石门系攻毒，免疫猪未表现出任何临床症状且产生了针对PRV和CSFV的中和抗体，表明构建的重组病毒可完全抵抗PRV和CSFV强毒的攻击。徐高原等[17]构建了表达乙型脑炎病毒NS1 基因的重组伪狂犬病病毒株TK-／gG-／NS1+，经检测重组病毒能表达具有生物活性的NS1蛋白，免疫仔猪能产生乙型脑炎病毒特异性抗体及CTL 活性。目前，关于PRV 病毒载体的重组疫苗均处于实验室研究阶段，希望将来能有所突破，开发出安全性好，免疫原性强的重组疫苗，达到PR根除的最终目标。