藏药四味辣根菜汤散对大鼠心肌缺血再灌注损伤炎症因子的影响*

保善录，李永芳，段雅彬，吉先才让 ，曹志东，王津慧 △

1 青海省人民医院中西医结合科，青海 西宁 810001; 2青海大学; 3 青海省藏医院

藏药四味辣根菜汤散系传统藏成药，藏药名为索洛西汤，由高山辣根菜、紫草茸、狭叶红景天及甘草组成。《四部医典》记载其具有滋阴清热和凉血止血的功效，主要用于治疗发烧、气短、目赤、唇舌及腮颊紫绀、喉堵声不扬、上体腔胀满、呼吸喘急、咯吐血痰为主的胸腔内恶血泛溢及心肺肿胀等症［1-4］。青藏高原地区的人们由于地理环境、民俗民风和膳食与平原地区不同，导致该地区心肌缺血疾病较平原地区多发。目前治疗手段主要有冠脉内溶栓术，冠脉内球囊扩张血管成形术及体外循环心内直视手术等。因缺血组织适应性代偿，冠状动脉经外科手术再通后易造成再灌注损伤，会对组织造成缺血和再灌注双重损伤。因此，寻找有效防治心肌缺血再灌注损伤、减少缺血发作、缩短冠脉再通时间、提高缺血再灌注心肌能量代谢的药物迫在眉睫。本研究应用现代药理动物实验方法，为藏药四味辣根菜汤散的临床应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 动物与分组48 只 8 周龄 SPF 级 Wistar 雄性大鼠，体质量（240±20）g，由兰州大学实验动物中心提供，实验动物合格证号：SCXK（甘）2013-0002；每笼8 只饲养于青海大学医学院实验动物中心；每日给足水和大鼠维持饲料；室温（20±2）℃，光照明暗12 h 交替；适应性喂养3 天。随机分为6 组：假手术组、模型组、阳性丹参组及四味辣根菜汤散低、中、高剂量组。

1.2 药物提取与给药将四味辣根菜汤散（青海省藏医院制剂科，散剂，批号：20130607）加水浸泡2 h，煎煮至沸腾后再煎30 min，过滤，加水重复上述过程2 次，合并2 次滤液，浓缩至50%浓度；丹参（毫州市远光中药饮片厂，散剂，批号：20140701）水提液制备方法同四味辣根菜汤散；完成后4℃避光保存备用。四味辣根菜汤散成人剂量为每日8 g/60 kg［即 0.2 g/（kg·d）］。低、中、高剂量等于成人剂量的5、10、15倍［即0.7、1.4、2.1 g/（kg·d）］，丹参粉成人每日 15 g/60 kg［即 0.25 g/（kg·d）］，大鼠灌胃量等于成人的7 倍［即1.75 g/（kg·d）］。假手术组和模型组灌胃等容积生理盐水，剂量为1.4 g/（kg·d）。每只大鼠每日灌胃1 次，连续 10天。

1.3 仪器BL-420S 型生物机能实验系统（成都泰盟公司）；HX-300S 型动物呼吸机（成都泰盟）；DNW-960型酶标分析仪（北京普朗有限公司）；UV-2550型紫外分光光度计（日本岛津公司）；H-600IV 型透射电子显微镜（日本Hitach 公司）；自制三叉玻璃气管插管和0.8 mm透明软聚丙烯塑料管。

1.4 试剂白细胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β；批号：E-30418）、白细胞介素6(interleukin-6，IL-6；批号：E-30644）、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factorα，TNF-α；批号：E-30633）、肌红蛋白（myoglobin，Mb；批号 ：E-30419）、超敏C 反应蛋白(high-sensitivity C-reactive protein，hs-CRP；批号：E-3025）试剂盒均购自英国Abcam公司（分装型）。

1.5 模型制备1）大鼠术前禁食6 h，20%乌拉坦5 mL/kg对大鼠实施腹腔注射麻醉。仰卧位固定，用电脑及BL-420S 生物机能实验信号采集系统连接心电图，记录Ⅱ导联心电图［4-7］。2）分离出气管，眼科剪倒T 剪开气管，自制三叉玻璃气管插管连接小动物呼吸机，调整呼吸机潮气量和频率与大鼠呼吸动作一致。3）碘伏胸腹部消毒，胸骨左缘0.5 cm 处剪开胸部皮肤，于2～4 肋间剪断第3和第4 肋，钝性分离肋间肌和胸膜，暴露心脏于视野，眼科镊撕开心包膜。穿5-0 号规格非吸收性缝合线从底部经过左冠状动脉左前降支，在左心耳与肺动脉圆锥交界处往下约1～2 cm处进针，深1.0～1.5 mm，宽2～3 mm。适应稳定心率5 min，将一根直径约0.8 mm，长约1.5 cm 的透明软聚丙烯塑料管置于结扎线与冠状动脉之间。贴紧并结扎缝合线，使透明软聚丙烯塑料管压迫冠状动脉造成冠脉闭塞，制作急性心肌缺血模型。4）肉眼观察结扎部位以下心肌表面颜色由鲜红变暗红，心电图QRS波群增高、增宽、ST段抬高为结扎成功表现［7］。5）缺血30 min 后用眼科剪剪断透明软聚丙烯塑料管及结扎线，形成再灌注状态，以心脏表面颜色转为鲜红和抬高的ST段下降在1/2以上为再灌注成功标志［8］，再灌注 90 min。6）假手术组大鼠只穿线不结扎左冠状动脉。

1.6 检测指标再灌注结束腹主动脉取血5 mL以上，离心半径 15 cm，4000 r/min 离心10 min，取上清液-80℃冰箱冷藏备用。用酶联免疫吸附法测定炎症因子水平。

1.7 统计学方法运用SPSS 20.0 软件分析数据，计量资料以（）表示，多组比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t法，检验水准为α=0.05。

2 结果

与假手术组比较，模型组大鼠血清IL-1β、IL-6、Mb、hs-CRP及TNF-α含量升高（P＜0.01）；与模型组比较，四味辣根菜汤散低、中、高剂量均能减少血清 IL-1β、IL-6、Mb、hs-CRP 及TNF-α含量（P＜0.05）；与阳性丹参组比较，四味辣根菜汤散低剂量组血清IL-1β、IL-6、Mb含量升高（P＜0.01），中、高剂量组hs-CRP 及高剂量组TNF-α降低（P＜0.01）。见表1。

表1 各组大鼠血清IL-1β、IL-6及Mb、hs-CRP与TNF-α含量（） ng/L

注：*表示与模型组比较，P＜0.01；#表示与阳性丹参组比较，P＜0.01

组别假手术组模型组阳性丹参组四味辣根菜汤散低剂量组四味辣根菜汤散中剂量组四味辣根菜汤散高剂量组TNF-α（ng/L）30.63±0.73*59.27±0.61 46.04±0.38*49.79±0.45*44.93±0.30*37.78±0.47*#鼠数8 8 8 8 8 8 IL-1β 2.77±0.11*8.89±0.20 3.58±0.08*4.63±0.11*#3.53±0.06*#3.26±0.04*#IL-6 16.43±0.09*26.14±0.15 14.05±0.13*18.38±0.19*#12.52±0.06*10.46±0.08*#Mb（ng/L）250.98±5.03*718.79±7.15 408.15±8.49*558.28±6.97*#355.34±7.22*#324.80±6.25*#hs-CRP（μg/L）0.60±0.01*3.09±0.03 1.29±0.06*1.75±0.09*0.93±0.01*#0.82±0.05*#

3 讨论

心肌缺血再灌注损伤的原因较为复杂，目前国内外公认与再灌注后细胞内Ca2+超载、氧自由基大量生成、微血管内皮细胞损伤及血管内皮细胞与白细胞/血小板之间的相互作用关系密切。IL-1β在炎症级联的上段，心肌缺血初期血清中有IL-1β表达［9］。本研究结果显示，心肌缺血再灌注模型组血清IL-1β含量高于假手术组，四味辣根菜汤散各药物组中IL-1β表达低于模型组，表明四味辣根菜汤散阻碍cAMP升高，抑制IL-1β释放，减轻心肌缺血再灌注损伤引起的炎症反应。血清IL-6 水平的变化与左冠状动脉阻塞引起的心肌梗死范围关联较大，更是后续严重并发症的预测因子［9］。本研究模型组中IL-6 含量较高，说明心肌缺血梗死后IL-6 信号转导受体成分“糖蛋白130”导致心肌细胞释放IL-6增多。四味辣根菜汤散各剂量组血清IL-6 含量较模型组低，表明在心肌缺血再灌注损伤时四味辣根菜汤散通过降低细胞内cAMP 浓度或腺苷和阿片受体延迟途径，抑制心肌细胞对IL-6的合成和释放。

急性心肌缺血再灌注损伤时，心肌中Mb 最先被释放入血液中，1～4 h 血液中Mb 超出正常上限，因此测定血清Mb 可作为急性心肌梗死诊断的早期项目［10］。模型组Mb 浓度高于假手术组，四味辣根菜汤散各剂量组Mb 含量降低，说明四味辣根菜汤散能抑制心肌缺血再灌注损伤Mb 释放入血，降低心肌耗氧量，减少炎症反应，从而保护心肌细胞。hs-CRP 是全身性炎症反应急性期的非特异性标志物之一，在心血管危险事件中具有较强的预测性。模型组hs-CRP 含量高于假手术组，四味辣根菜汤散各剂量组hs-CRP 含量低于模型组，说明四味辣根菜汤散能有效抑制由心肌缺血再灌注损伤引起的炎症反应，保护心肌和心肌细胞。TNF-α参与组织损伤引起的炎症反应和免疫反应［11-12］。心肌缺血再灌注模型组大鼠血清中TNF-α含量高于假手术组，四味辣根菜汤散各剂量组大鼠血清TNF-α含量低于模型组，说明四味辣根菜汤散能降低心肌成纤维细胞分泌TNF-α。

可见，四味辣根菜汤散能够干预Akt/NF-κB信号途径的激活，抑制心肌成纤维细胞释放IL-1β、IL-6、Mb、hs-CRP 及 TNF-α等炎症因子，减轻心肌缺血再灌注过程中的旁分泌炎症因子释放，对心肌缺血再灌注损伤具有间接保护作用。