Eph/Ephrin信号通路在缺血性心脏病血管生成中的研究进展

施国荣 刘婷婷 田欣 祝自新 郑文荣 王宇峰 孙芳玲 王文

(北京市老年病医疗研究中心 首都医科大学宣武医院实验动物室，北京 100053)

近年来缺血性心脏病的发病率和死亡率居高不下，如何有效地改善心脏功能和预后一直是缺血性心脏病治疗的难题。寻求有效的靶点和策略解决心肌受损和微血管数量减少的问题，对增加心肌再灌注和恢复心脏功能有重大的意义[1]。Eph/ephrin家族是哺乳动物体内最大的酪氨酸激酶受体家族，在心脏发育过程中至关重要[2]。研究证实，缺乏EphrinB2或EphB4的小鼠胚胎会死于严重的心血管系统畸形[3]。而在缺血性心血管疾病中，缺血缺氧可诱导内皮细胞(endothelial cell，EC)、周细胞和炎症细胞等不同细胞的Eph/ephrin信号的表达，诱导血管生成，进而恢复受损心脏的功能[4]。现对Eph/ephrin信号家族在心血管发育和缺血性心脏病中的作用进行综述，此外还将介绍几种有关Eph/ephrin信号潜在的治疗方式，以期为缺血性心脏病后的再生修复治疗研究提供线索。

1 Eph/ephrin家族

1.1 Eph/ephrin家族结构特点和功能

Eph/ephrin信号通路是一类非常保守的蛋白受体酪氨酸激酶家族，根据序列的同源性、锚定方式及结合嗜性等分为A和B两个亚型，目前Eph/ephrin在哺乳动物的体内共有14个受体和8个配体，包括EphA(A1～A8和A10)、EphB(B1～B4和B6)、EphrinA(A1～A5)和EphrinB(B1～B3)。Eph受体都具有相似的结构：细胞外部分、单个跨膜区域和胞浆内部分[5]。细胞外部分由球形配体结合结构域组成：一个类似表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)、富含半胱氨酸的区域和两个纤连蛋白Ⅲ型的重复序列。细胞内部分由近膜部分、酪氨酸激酶区域、无菌α基序结构域和postsynaptic density-95/discs large/zona occludens-1(PDZ)结合结构域组成[6]。与Eph相比，EphrinA和EphrinB具有不同的结构，EphrinA在细胞外部分具有Eph受体结合结构域并通过糖基磷脂酰肌醇连接至细胞膜，无胞质结构域；而EphrinB包含一个Eph受体结合结构域、一个跨膜区域和一个胞质部分，其中胞质部分具有多个酪氨酸和丝氨酸磷酸化位点以及一个PDZ结合基序[7]。研究发现，EphB4是EphrinB2的特异性受体[7]。

Eph/ephrin信号的传导是双向的，即Eph和Ephrin可互相激活。Ephrin激活相邻细胞，Eph受体的胞质内酪氨酸激酶结构域通过自磷酸化来启动正向信号传导；Ephrin的末端区域可通过PDZ依赖的方式来启动反向信号传导。Eph/ephrin调控的双向信号传导在心脏发育中具有重要意义，可指导心肌循环的完成、心内膜的扩张、心肌小梁形成和心脏瓣膜的形成以及心脏谱系分化的发展[8]。除心脏发育外，Ephrin信号还参与病理性心脏重构过程，包括心肌缺血后线粒体功能调节和心脏损伤或心肌纤维化后的血管新生等过程。

1.2 EphB4下游信号传导方式

EphB4下游信号传导具有复杂的机制。PI3K/Akt信号通路可介导EphB4诱导EC增殖，抑制EphB4可降低Akt磷酸化，从而抑制细胞的增殖[5]。使用PI3K、Akt、PKG和甲乙酮(methyl ethyl ketone，MEK)的阻滞剂可抑制EphB4诱导EC增殖。但Ras和Src信号传导途径对增殖反应无影响[3]。Akt可特异性磷酸化内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)，增加EphB4激活后的亚硝酸盐的产生，从而激活cGMP-PKG信号通路[6]。cGMP-PKG信号通路可激活下游信号Raf产生MEK，因而EphB4诱导的增殖信号部分可能是通过PI3K/Akt-eNOS/NO-cGMP/PKG-Raf/MEK激酶级联介导的[6]。

1.3 EphrinB2下游信号传导方式

与正向EphB4信号传导不同，由于缺乏内在的催化活性，EphrinB2介导的反向信号依赖于募集信号分子[2]。EphrinB2的反向信号募集信号分子的方式有两种。其一，EphrinB2的磷酸化由Src家族激酶的募集介导，然后与含SH2/SH3域的衔接子蛋白如Grb4和信号转导及转录活化因子3结合[2]。Grb4诱导多种细胞骨架调控信号介导EC的迁移，例如局部黏着斑激酶、G蛋白偶联受体激酶1、动力蛋白、Cbl相关蛋白、Abl相互作用蛋白和p21活化激酶[2]。信号转导及转录活化因子3蛋白将EphrinB信号从细胞膜传递到细胞核，通过EphrinB反向信号传导参与到细胞外基质介导的EC和周细胞的组装过程中。其二，含PDZ的蛋白质被募集到EphrinB2的PDZ结合基序上，用于介导磷酸化无关的信号传导，这对于血管生成过程以及新生血管的稳定非常重要[2]。含PDZ蛋白质的G蛋白信号调控因子和蓬乱蛋白2可能与依赖PDZ的EphrinB2反向信号传导有关[2]。含PDZ蛋白质的G蛋白信号调控因子可能通过调节G蛋白信号通路来介导EphrinB2反向信号传导，但是EphrinB2反向信号介导血管生成的准确机制还需进一步地研究。

1.4 Eph/ephrin信号通路与其他信号通路之间的串扰

Eph/ephrin信号通路参与肿瘤血管生成、肿瘤生长和转移扩散的关键过程。通过肿瘤细胞-血管细胞相互作用和血管细胞中受体非依赖性的Ephrin功能，EphrinB2和EphB4调节肿瘤新血管的形成[9]。通过传导肿瘤血管生成信号血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)/血管内皮生长因子受体(vascular endothelial growth factor rcceptor,VEGFR)的受体VEGFR2和VEGFR3，EphrinB2可调节肿瘤的生长和血管形成[9]。

在缺血性心脏病中，DLL4/Notch和VEGF/VEGFR信号通路都会与Eph/ephrin信号通路发生串扰且影响血管的新生。通过VEGF诱导DLL4/Notch是新生血管形成中必不可少的途径，且可选择性地促进EphrinB2的表达[10]。VEGF通过PI3K/Akt途径激活叉头框转录因子诱导DLL4-Notch信号传导[10]。Notch信号通过转录介质RBPJ蛋白参与EphrinB2的表达[7]。通过阻断DLL4和使用可溶性EphrinB2治疗，诱导心脏中非功能性血管的生成，进而增加血管密度。

2 Eph信号与血管生成

2.1 Eph信号在心脏血管发育中的作用

EphrinB2是Eph/ephrin家族在心脏发育中非常重要的成员。EphrinB2全基因敲除小鼠会在胚胎期的第11.5天死亡，该类小鼠的心脏经观察后发现有心脏循环不完全、心内膜扩张失败和心肌小梁形成缺陷等问题[11]。敲除EphrinB2的PDZ结合结构域(抑制EphrinB2反向信号)导致的小鼠死亡率与EphrinB2整体敲除的无差异，说明在心脏早期发育的过程中EphrinB2是传导反向信号的配体；而敲除EphrinB2的PDZ结合结构域后注射β半乳糖则可使小鼠胚胎发育完全且正常出生，这表明EphrinB2突变蛋白保留了表面结合活性且可介导正向信号传导。由此可见EphrinB2的双向传导都参与胚胎期的心脏发育过程[12]。

在心脏血管发育过程中，EC与其他支持细胞通过自分泌和旁分泌形式激活EphrinB2的双向传导[13]。EphrinB2参与VEGF信号传导促进发育性血管生成，参与方式是通过EphrinB2依赖于PDZ的反向信号调控EC中VEGF的受体VEGFR2和VEGFR3[14]。EphB4也能通过磷酸化细胞外调节蛋白激酶调节VEGFR2信号传导。

2.2 Eph/ephrin信号在缺血性心脏损伤后血管生成中的作用

血管重建可治疗心肌梗死和缺血再灌注损伤，且促进受损的心肌恢复[15]。新血管的生成有以下三种方式：通过出芽的方式从先前存在的血管中生成毛细血管，由内皮祖细胞生成新血管和由小侧支动脉形成血管。

EphrinB2和EphB4可促进小鼠心肌梗死模型中功能性新血管的生成，但EphrinB2在体外培养的EC中的过度表达则无法导致细胞形态和功能的改变[16]。因此使用EphrinB2-Fc(重组小鼠EphrinB2蛋白)可能成为促进缺血性心血管疾病早期血管新生的有效途径。在培养的人主动脉EC中，EphrinB2-Fc可诱导细胞增殖；在小鼠主动脉环血管生成模型中，EphrinB2-Fc可诱导出芽式血管形成；小鼠心肌梗死后梗死区的EC增殖加速，在用EphrinB2-Fc治疗后EC增殖速度更快[17]。在结扎小鼠左前降支动脉诱发心肌梗死模型后的第2天开始每天腹腔注射EphrinB2-Fc 20 μg/25 g，分别取14 d和28 d的小鼠心脏进行免疫荧光染色，发现14 d的小鼠心脏在心肌中检测出EC有丝分裂增加；28 d的小鼠梗死周围的毛细血管密度增加28%，达到未梗死区域相同的水平[17]。

EphrinA1蛋白和EphA受体在心肌梗死后血管生成中也有显著作用。由肿瘤坏死因子-α、白介素-1β和VEGF诱导EphrinA1通过整合素αvβ3刺激EC黏附和细胞骨架改变，最终引起旧血管的不稳定[18-19]。VEGF和肿瘤坏死因子-α也通过诱导EphA1的表达，引起EC迁移和血管生成。而在心肌梗死发生后，心肌细胞中EphrinA1的表达量增加。通过在永久性冠状动脉闭塞小鼠模型的心肌中注射EphrinA1-Fc可显著调节Eph受体的mRNA表达变化：EphA1的表达显著增加，导致梗死面积的减少[20]。通过阻塞冠状动脉左前降支30 min制作小鼠的缺血再灌注模型，结扎后立刻在梗死的边缘注射EphrinA1-Fc，使梗死面积比对照组减少46%，蛋白代谢水平得以恢复正常，心脏能正常运行[20]。对小鼠的缺血再灌注模型使用EphrinA1-Fc的优异表现说明外源性给予EphrinA1-Fc起到的心脏保护作用可能是以后心肌梗死的有效治疗方式。

3 Eph/ephrin信号潜在的治疗方式

3.1 蛋白酶分解EphrinB家族配体

EphinB家族配体(EphrinBs)的蛋白酶调节对于发育和疾病具有广泛的意义。特异性蛋白酶的阻断可能是抑制异常的EphrinBs功能的有效方法。使用蛋白酶将EphrinBs的胞外、跨膜和胞内结构域分离，从而避免与Eph相互作用[21]。其中去整合素-金属蛋白酶(a disintegrin and metalloprotease，ADAM)家族的蛋白酶ADAM10，可在细胞外裂解EphrinB2，而ADAM8和ADAM13可裂解其他EphrinBs[22]。此外，基质金属蛋白酶也可胞外裂解EphrinBs。通过与EphBs的相互作用，基质金属蛋白酶8裂解EphrinB1作用得到增强[22]。这些EphrinBs胞外域的蛋白水解片段保留了与EphBs的结合活性，还具有调节胚胎发育、血管生成和心肌纤维化的功能。另外γ分泌酶分解EphrinB2的胞内结构域可使EphrinB2反向信号得到增强[22]。

3.2 重组细胞外结构域和抗体

Eph/ephrins的重组细胞外结构域(extracellular domain，ECD)已被广泛地研究，作为可溶性替代物激活和抑制双向信号传导[23]。EphrinB2-Fc可通过激活EphB正向信号传导进而促进血管生成[23]。ECD与Fc结构域或白蛋白的偶联可进一步延长其在体内的半衰期[23]。将EphrinB2 ECD与仿生纤维蛋白载体共价偶联，可实现EphrinB2的靶向传递[24]。这种靶向传递可使得局部血管得以重建，促进其局部治疗性血管的生成[24]。近年来，新型的EphrinB2 ECD可溶性生物聚合物及EphrinAs ECD纳米颗粒被制备出来，这些纳米级技术可在靶细胞中准确调节Eph/ephrin信号传导，这在新兴的纳米疗法中具有广阔的前景[24]。

虽然EphrinB2 ECD可作为可溶性配体激活EphBs，但可溶性的EphB4(soluble EphB4,sEphB4)ECD及其优化形式sEphB4-HAS(将人血清白蛋白和sEphB4融合)可抑制EphB4/ephrinB2双向信号[22]。由于EphB4/ephrinB2双向信号被抑制，体外EC会发生功能障碍以及体内治疗性血管重建无法正常运行。因此，sEphB4可用于抗血管生成治疗和抑制EphrinB2反向信号。此外，特异性靶向EphrinB2和EphB4的抑制性抗体在抑制血管生成以及治疗肿瘤方面有较高的疗效[25]。

4 总结与展望

Eph/ephrin信号通路作为心脏发育过程中的关键调控途径，在缺血性心脏病的病理生理过程和治疗策略研究中具有重大意义。目前对其治疗缺血性心脏病的研究还停留在临床前研究阶段。在动物实验中通过外源性地给予EphrinB2-Fc和EphrinA1-Fc等可促进心脏中的血管生成。通过基质金属蛋白酶、ADAM和γ分泌酶等裂解EphrinB，合成Ephrin或Eph重组ECD，将为调控Eph/ephrin信号治疗缺血性心脏病提供潜在方法。