心血管内皮细胞放射性损伤机制的研究进展

王梦迪 李敏 曹璐 许赪 欧丹 王舒蓓 陈佳艺

(上海交通大学医学院附属瑞金医院放射治疗科，上海 200025)

放射性心脏疾病(radiation-induced heart diseases，RIHD)是指放射线引起的一系列早期或晚期的心血管并发症，它抵消了由放射治疗(放疗)产生的部分生存获益，已成为胸部放疗患者非肿瘤性死亡的主要原因之一[1]。近年来，随着放疗技术的改进，心脏的辐射剂量和受照射体积显著降低，但仍无法避免RIHD。潜伏期较长的慢性RIHD受到了越来越多研究者的关注[2-3]。

心血管内皮细胞对放射线的敏感性高于高度分化的心肌细胞，与蒽环类化疗药物直接造成心肌损伤不同，RIHD主要为继发于微血管损伤的结果[4]。心血管内皮细胞损伤是RIHD的始动环节，长期或反复照射可诱发血管内皮细胞功能紊乱，形成微血栓并堵塞管腔，进而毛细血管密度进行性降低，最终心肌组织局灶性缺血缺氧并启动促纤维化进程[5]。研究心血管内皮细胞放射性损伤作用机制，对于早期预防RIHD、改善胸部放疗患者预后具有重要的临床价值。现重点综述RIHD中心血管内皮细胞损伤机制及潜在的保护策略。

1 炎症反应损伤机制

1.1 高剂量辐射诱导内皮细胞产生无菌性的炎症损伤

多项研究表明，大于2 Gy的高剂量辐射即可诱导内皮细胞产生无菌性的炎症反应[6-8]。可能的原因是辐射引起内皮细胞DNA双链断裂、活性氧(reactive oxygen species，ROS)生成和损伤相关分子模式的释放，共同激活了核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)相关信号通路。进而以时间和剂量依赖的方式上调内皮细胞表面的黏附分子[细胞间黏附分子(intercelluar adhesion molecule,ICAM)-1、ICAM-2、E选择素和血管细胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)]的表达和各种促炎细胞因子[白介素(IL)-1、IL-6、IL-8、肿瘤坏死因子-α、转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)、γ干扰素、C-C趋化因子配体2、C-C趋化因子配体5和单核细胞趋化蛋白-1]的释放，影响了内皮细胞与白细胞之间的相互作用，最终破坏了血管屏障的完整性和通透性[6-10]。

过氧化物酶体增殖物激活受体α(peroxisome proliferator-activated receptor α，PPARα)是内皮细胞脂质代谢的关键调节因子，参与内皮细胞炎症信号转导。伴随着辐射诱导的黏附分子表达上调，糖原合成酶激酶-3β的活性也随之增加。活化的糖原合成酶激酶-3β通过磷酸化修饰PPARα，使PPARα泛素化增加，不仅抑制了PPARα的表达，还间接激活了NF-κB信号通路，进一步加剧了辐射诱导的炎症反应[3，11]。

1.2 低剂量辐射诱导内皮细胞产生部分抗炎保护作用

与高剂量辐射诱导内皮细胞产生促炎反应相反，低剂量辐射可诱导内皮细胞产生抗炎效果，原因可能是低剂量放射线激活了内皮细胞的抗炎保护系统。研究表明在0.3 Gy和1 Gy的低剂量照射下，内皮细胞表面的黏附分子(ICAM-1和E选择素)的表达减少，降低了内皮与单核细胞之间的黏附性[12-13]。另一项研究也报道了经0.025～0.5 Gy的低剂量照射的ApoE-/-小鼠，3或6个月后检测其心脏组织及血浆标本中的促炎标志物(ICAM-1、VCAM-1、E选择素和Thy1)的表达均降低。这些研究结果均提示可能存在某个剂量阈值，使得经低于该阈值剂量照射的内皮细胞免受炎症反应损伤[7]。

1.3 内皮细胞炎症反应促进心肌纤维化

辐射后血管内皮细胞释放的促炎因子TGF-β通过旁分泌的方式，进一步激活心肌细胞内经典的Smad依赖型信号通路，促进心肌纤维化。具体表现为Smad2和Smad3的磷酸化增强以及Smad4水平的增加。此外，TGF-β还可通过磷酸化TGF-β激活激酶1，触发一系列的丝裂原活化蛋白激酶级联反应，如磷酸化胞外信号调节激酶、p38丝裂原激活的蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase，p38 MAPK)和Jun激酶后激活非Smad依赖型信号通路[14-15]，最终导致心肌细胞凋亡，成纤维细胞增殖和胶原蛋白沉积增多，加快了心肌纤维化的进程。

1.4 针对炎症反应损伤的潜在保护策略

抑制辐射后内皮细胞黏附分子的表达及促炎因子的释放是缓解炎症反应损伤的关键路径之一。Soroush等[16]研究发现，抑制炎症反应关键调节因子蛋白激酶C-δ的活性，则能有效下调辐射诱导的黏附分子(P选择素、ICAM-1和VCAM-1)的过表达，显著减少中性粒细胞与内皮细胞之间的相互作用，改善辐射引起的血管内皮细胞的通透性增加。Christersdottir等[17]研究表明对胸部放疗后的ApoE-/-小鼠，随即腹腔注射连续两周的IL-1受体拮抗剂——Anakinra，在放疗结束第10周时，小鼠主动脉中的促炎因子C-C趋化因子配体2和C-C趋化因子配体5的mRNA水平以及I-Ab MHC-Ⅱ类抗原水平发生显著下调。说明放疗后早期应用Anakinra可减少辐射诱导的炎症介质的持续表达，从而可能降低长期慢性炎症反应诱发的晚期心血管疾病的风险。

2 氧化应激损伤机制

放射线诱导过量的ROS产生引发内皮细胞的氧化应激损伤一直是研究的热点问题。ROS既能激活细胞的氧化还原反应敏感性转录因子激活蛋白-1和NF-κB，间接参与内皮细胞的炎症和氧化反应，ROS还能激活抗氧化系统的关键转录因子，从而启动细胞的抗氧化防御机制[18]。因此，辐射诱发内皮细胞氧化应激损伤的原因是细胞内氧化与抗氧化系统失衡，使其向着氧化反应的方向发展[11]。

2.1 ROS降低NO的生物利用度

NO的生物利用度降低是辐射诱导的内皮依赖性血管功能障碍的主要原因之一。一方面，ROS使NO快速失活，形成过氧亚硝酸盐等活性氮，该过程远远超过超氧化物歧化酶产生超氧化物的速度，增加了ROS的促炎症负荷[3，19]。另一方面，ROS的过量释放使NO生成减少。主要与ROS诱导内皮型NO合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)解偶联，eNOS的重要辅因子四氢生物喋呤含量减少，以及eNOS的上游PI3K-Akt-mTOR信号通路失活导致有关eNOS激活障碍[11，20-21]。在辐射早期，NO的释放量有一过性增加的现象[9]，原因可能是eNOS活性可被辐射诱导的DNA损伤反应信号通路所激活，但照射后24 h内大多数内皮细胞的DNA损伤信号通路终止反应[9-10]，eNOS活性又随之降低，最终发生血管不可逆的功能障碍[22]。由于内皮释放的NO能扩散至心肌细胞，具有调节心肌收缩的功能，因此，内皮细胞NO生物利用度降低还可间接损伤心肌细胞[23]。

2.2 ROS通过p38 MAPK/核仁磷蛋白/蛋白磷酸酶2A复合体诱导内皮细胞DNA损伤

p38 MAPK级联通路是介导辐射诱导的氧化应激反应的重要信号通路之一。核仁磷蛋白(nucleophosmin，NPM)是一种对ROS信号敏感的能发挥多种细胞学功能的核糖核蛋白，其磷酸化状态受ROS浓度的影响。蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2A，PP2A)是常存在于胞质中的丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶家族的成员，能使NPM的第199位上的苏氨酸残基(T199)发生去磷酸化。正常情况下，p38 MAPK/NPM/PP2A是以复合体形式存在于内皮细胞质中，该复合体对急性氧化应激反应具有很高的敏感性。当内皮细胞的ROS浓度异常升高时，PP2A将被激活，使NPM发生去磷酸化，随后NPM从p38 MAPK/NPM/PP2A复合体中解离，并迅速移位到细胞核以转录因子的形式诱发DNA损伤。其可能的机制是T199位去磷酸化的NPM通过转录调控抑制了毛细血管扩张性共济失调突变基因的表达，及其下游的DNA依赖蛋白激酶催化亚基的磷酸化，进而使DNA损伤修复通路受损，最终断裂的DNA双链发生不可逆的损伤。此外，ROS还能使该复合体中的p38 MAPK发生磷酸化，进一步激活p38 MAPK的下游效应元件，发挥肌动蛋白重塑以及细胞凋亡和衰老等生物效应[24]。

2.3 ROS诱发线粒体功能障碍

细胞中ROS的主要生成部位在线粒体，是氧化磷酸化代谢的副产物。少量的ROS可充当信号分子维持细胞正常的代谢功能，但随着辐射剂量的增高，氧化应激持续增强，产生大量的ROS则会充当炎性介质，破坏线粒体正常结构。Lafargue等[25]发现15 Gy X射线可诱导产生持续性的氧化应激，导致线粒体功能障碍和内皮细胞早衰；Azimzadeh等[11]用8 Gy和16 Gy X射线照射C57BL/6小鼠心脏微血管内皮细胞后，发现与线粒体功能障碍相关的蛋白表达上调。Hu等[26]发现γ射线剂量为5～20 Gy时，可诱导ROS水平呈剂量依赖性增加，线粒体活性随之降低。

2.4 针对氧化应激损伤的潜在保护策略

外泌体是生物体内传递信息的载体。缺氧处理后，处于氧化应激状态的心肌细胞能释放转运多种生物活性物质的外泌体，促进内皮细胞的增殖存活及血管新生[27-28]，这启发笔者电离辐射背景下也可能诱导类似的心肌细胞来源外泌体对内皮细胞的保护。Wang等[29]研究发现，氧化应激环境下，心肌细胞能分泌高表达环状RNA circHIPK3(circular RNA HIPK3，circHIPK3)的外泌体，经细胞膜融合、细胞内吞等途径将circHIPK3传递至心脏微血管内皮细胞中。circHIPK3通过“海绵样”吸附血管生成抑制因子miR-29a，使miR-29a不能与下游靶基因胰岛素样生长因子1结合，减弱了miR-29a对胰岛素样生长因子1的抑制作用，从而有效缓解了氧化应激诱导的内皮细胞功能障碍。

3 内皮细胞衰老损伤机制

数天到数周出现的急性辐射效应与细胞的凋亡密切相关，而数月到数年显现的慢性辐射效应则主要与细胞的衰老相关[30]。在当今放疗技术显著改进的背景下，慢性辐射损伤更为常见，因此，内皮细胞衰老损伤更具探讨价值。辐射诱导内皮细胞衰老的机制尚未阐明，目前已知放射线可通过多种途径促进内皮细胞的衰老，例如：DNA的损伤、持续的炎症状态、线粒体的氧化应激、端粒的缩短和p53的激活等[9，25]。

3.1 辐射对内皮细胞衰老的直接影响

Azimzadeh等用8 Gy或16 Gy高剂量X射线照射小鼠心脏后，检测到一系列血管内皮细胞衰老相关事件的增多。如：衰老标志物(p21、p16和p53)，黏附分子(ICAM-1、ICAM-2和VCAM-1)，血清中促炎细胞因子(肿瘤坏死因子-α、IL-1和IL-6)呈现剂量-时间依赖性升高。此外，该研究团队在两项研究中均证实了辐射诱导的内皮细胞衰老与PI3K-Akt-mTOR信号通路的级联失活有关。该通路的失活将下调其下游的Rho GDI通路活性，上调p53-p21通路活性，进而导致细胞骨架紊乱以及细胞生长抑制[11，31]。Baselet等用0.05 Gy低剂量X射线单次照射体外培养的内皮细胞，14 d后观察到β-乳糖苷酶染色活性增强和胰岛素样生长因子结合蛋白7分泌增加等过早衰老迹象。一个可能的机制为辐射诱导的DNA损伤激活了Nemo/NF-κB信号通路，促进了IL-6的表达和p53的激活，从而驱动了细胞周期阻滞的发生及促炎微环境的形成[10，32]。然而，现有研究仍无法证实是否存在诱导内皮细胞衰老效应的最低阈值剂量，但可以肯定的是内皮细胞衰老的程度与速率具有剂量-时间依赖性。

3.2 辐射对内皮细胞衰老的间接影响

衰老的内皮细胞尽管丧失了复制潜能，但仍处于代谢活跃的状态。它们可分泌出由促炎细胞因子、趋化因子、生长因子和蛋白酶组成的衰老相关分泌表型，间接影响邻近的未受照射的细胞和组织，诱发更多的细胞衰老反应和组织炎症损伤，该过程也被称为辐射的旁观者效应。用10 Gy X射线照射体外培养的人冠状动脉内皮细胞(HCECest2)14 d后，将其产生的外泌体与未受照射的HCECest2进行共培养24 h。观察到未受照射的HCECest2细胞表现出同受照射HCECest2细胞相似的炎症反应。可能的机制是受照射细胞外泌体中高表达的IL-6介导了未受照射HCECest2细胞内发生Ⅰ型干扰素反应及通过p38 MAPK激活了信号转导及转录激活蛋白3信号通路[33]。

3.3 针对内皮细胞衰老的潜在保护策略

基质细胞衍生因子-1(stromal cell-derived factor 1，SDF-1)主要依赖CXC家族趋化因子受体4(CXC chemokine receptor 4，CXCR4)发挥抗辐射诱导的内皮细胞衰老的作用。用重组人SDF-1蛋白处理衰老的人脑微血管内皮细胞，通过ERK和信号转导及转录激活蛋白3的激活，可显著增加受体CXCR4以及DNA损伤修复基因(例如：NBS1、53BP1、BRCA1和Chk1)的表达，同时抑制细胞衰老相关表型的表达。此外，将CXCR4的激动剂ATI2341注射入小鼠体内，能显著降低辐射诱导的脑血管内皮细胞功能障碍，保障正常的脑血流量[34]。这些结果均表明利用SDF-1和ATI2341有望成为修复放疗期间受损血管内皮细胞的潜在治疗方法。

4 其他损伤机制

4.1 凝血系统损伤机制

放射线破坏微血管的凝血系统动态平衡，使其朝着促凝和促血栓方向转变。分次或单次高剂量照射均可促使ApoE-/-模式小鼠产生易于出血的炎性动脉粥样斑块[35]。主要原因有：(1)因辐射受损的内皮细胞减少了抗凝剂NO和前列环素的释放，导致了促凝状态的形成。(2)长期来看，损伤的血管内皮细胞中凝血酶调节蛋白(thrombomodulin，TM)的表达呈下降趋势，却增加了血管性假血友病因子、纤溶酶原激活物抑制物1型(plasminogen activator inhibitor type 1，PAI-1)和血小板激活因子等的合成，促进了血小板的黏附和聚集，有利于血管促血栓状态的形成。此外，大量释放的促炎细胞因子则可抑制TM的活性，进一步上调组织因子、PAI-1和血管性假血友病因子的表达，加剧凝血系统失衡[6，8-9]。

最新研究表明普伐他汀能降低辐射后血栓形成风险。普伐他汀通过诱导照射后血管内皮细胞中TM的表达，不仅下调了PAI-1和黏附分子(ICAM-1和VCAM-1)的转录，同时抑制了炎症因子(IL-1、CXCL1、肿瘤坏死因子-α和单核细胞趋化蛋白-1)的释放，达到了抗血栓形成的作用[36]。

4.2 肾素-血管紧张素-醛固酮损伤机制

肾素-血管紧张素-醛固酮系统参与多种心血管疾病的形成。例如当患有冠状动脉粥样硬化、高血压或心肌纤维化等疾病时，心脏组织中血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)、血管紧张素转换酶(angiotensin converting enzyme，ACE)和醛固酮的合成将会增加。同样的，不少研究证实在RIHD中也存在着类似规律。大鼠心脏组织经15 Gy和18 Gy射线照射后，检测到ACE、AngⅡ、AngⅡ受体1及醛固酮水平明显高于对照组[37-38]。Korystova等[39]实验结果提示照射后单核细胞与血管内皮细胞的黏附作用能促进ACE活性的升高和AngⅡ的合成，进而增多的AngⅡ可借助AngⅡ受体1信号途径诱导内皮功能障碍。

黄酮类(flavonoids)化合物与目前广泛用于治疗高血压和预防动脉粥样硬化的血管紧张素转化酶抑制剂药物作用机制相类似，可通过抑制辐射诱导升高的ACE活性，调节肾素-血管紧张素-醛固酮系统，减轻内皮功能障碍。黄酮类化合物具有安全无毒和副作用较小等特性，故对于一些患者来说，黄酮类治疗可能取得比血管紧张素转化酶抑制剂类药物更好的疗效[40]。

5 小结

临床研究已证实放射性心脏损伤是抵消放疗生存获益的重要因素。在精准放疗技术时代，心脏受照射的剂量体积较二维放疗时代有了大幅度降低，但远未降至零水平，无法完全避免心脏局部高剂量和大面积低剂量的辐照影响。随着胸部肿瘤放疗患者的生存期不断延长，发现更多有效缓解与治疗RIHD的临床方案尤为重要，而探究血管内皮细胞的放射性损伤机制或许是一个关键性突破口。目前此类研究尚处于初步阶段，特别是对低剂量照射后的长期慢性损伤效应机制仍缺乏关注，需进一步的研究来更好地阐明心血管内皮细胞放射性损伤及保护机制，以期为未来转化医学研究提供参考。