COX-2在动物卵泡发育过程中的研究进展

张琼文，张叁保，杨丽丽，高小童，刘笑笑，陈 婷，江明生

(广西大学动物科学技术学院，广西 南宁 530004)

0 引言

雌性动物的繁殖能力直接影响畜牧业的经济效益，卵泡的发育在动物繁殖过程中占有重要地位，而卵泡发育主要受分子调控的影响。环氧合酶(cyclooxygenase，COX)有COX-1和COX-2两种亚型，其中COX-2为诱导型酶，即在外界条件变化时，如损伤、缺氧、卵泡增大等条件下，COX-2表达水平升高，而一般情况下表达很低。COX-2参与多种生理过程，能够调节活性氧(Reactive Oxygen Species，ROS)水平，参与PI3K/AKT/NOTCH/Wnt信号通路的调节，对卵泡发育的调控起到重要作用。本文就COX-2在卵泡发育过程中的调节机制，结合相关文献展开综述。

1 影响卵泡发育的因素

卵泡是雌性体内性激素合成及卵子发育成熟到排卵的基本单位，由卵母细胞、颗粒细胞和膜细胞组成。初级卵母细胞是通过原始生殖细胞(primordial germ cells，PGCs)分化的卵原细胞经过减数分裂被阻滞在双线期形成。原始卵泡是卵泡发育的基础，初级卵母细胞被单层扁平的前体颗粒细胞包围后形成了原始卵泡，出生后两侧卵巢上便具有上百万个原始卵泡[1]。随着前体颗粒细胞的增殖且变成立方状及卵母细胞的生长，标志着原始卵泡被募集并启动，发育为初级卵泡。初级卵泡分裂形成次级卵泡(secondary follicle)。

1.1 卵巢颗粒细胞的增殖分化与卵泡发育

颗粒细胞的增殖与分化能促进卵泡生长、成熟。促卵泡激素(FSH)和卵泡受体( FSHR)结合，促进卵泡生长和发育，刺激卵巢分泌雌激素，从而产生成熟卵泡。FSHR主要在颗粒细胞中表达，颗粒细胞在卵泡优势发生时获得功能性的促黄体生成素受体(luteinizing hormone/choriogonadotropin receptor，LHR)，LH与LHR结合使成熟卵泡发育成为优势卵泡，并最终排卵[2]。颗粒细胞的生长、增殖与分化影响着原始卵泡发育的启动卵泡选择，在整个卵泡发育过程中发挥重要作用[3]。

1.2 颗粒细胞凋亡、氧化应激与卵泡闭锁

在动物初情期后，一些卵泡开始生长并在每一个发情周期都会选择性的排卵，并且在整个雌性生殖期内都进行着周而复始的循环，但是在动物整个繁殖周期中只有一小部分卵泡能够成功发育至排卵前卵泡并排卵，超过99%的卵泡都将在卵泡发育的过程中发生退化闭锁[2]。在雌性哺乳动物的生殖发育过程中，由颗粒细胞凋亡引起卵泡闭锁，保留了最健康的卵泡(含有最佳质量的卵母细胞)，完成最终的排卵。目前，导致卵泡闭锁的主要原因是颗粒细胞的凋亡[4-5]，上调颗粒细胞中促凋亡基因Bax和P53，下调抗凋亡基因 Bcl-2是影响颗粒细胞凋亡主要调节因子[6]，影响卵泡闭锁。线粒体途径，死亡受体途径，内质网应激以及氧化应激等信号通路介导细胞凋亡[7-8]。有研究表明，人类卵泡发育过程中的细胞凋亡仅见于生长卵泡中的颗粒细胞，有腔卵泡的颗粒细胞中经常检测到细胞凋亡的发生，然而在卵泡发生的早期阶段只能检测到极少量的颗粒细胞发生凋亡[9]。检测人类生长卵泡中的颗粒细胞中抗凋亡基因Bcl-2和促凋亡基因Bax的表达，发现Bax从初级卵泡阶段开始就有明显表达，而抗凋亡基因Bcl-2的表达主要表达在有腔卵泡及部分次级卵泡的颗粒细胞中[10]，P53在闭锁卵泡及凋亡颗粒细胞中的表达上调[11]。

活性氧(Reactive Oxygen Species，ROS)为一类小分子物质，是在生物体有氧代谢过程中产生的，主要包括超氧化物、过氧化物及氧自由基等。细胞内的活性氧主要来源于呼吸链经氧化磷酸化产生ATP的过程中由线粒体释放[12]。正常情况下少量的活性氧对细胞信号传导、激素分泌、细胞生长等是必需的；然而在一定内源或外源因素的影响下，细胞内的活性氧会超过正常水平，由于活性氧分子通常拥有核外未配对的电子，具有很强的化学反应活性，此时活性氧会攻击细胞内的一些小分子，如脂类、蛋白质及核酸等，导致细胞核和线粒体的DNA降解，引起细胞内蛋白变性，一些重要的酶类失活，细胞膜脂质过氧化等，最终引发细胞凋亡。有研究表明，活性氧浓度越高，越容易加速卵母细胞衰老，降低卵母细胞质量，导致卵母细胞调亡[12]。向体外培养的卵母细胞的培养基中加入H2O2刺激后，卵母细胞会出现胞质颗粒化、细胞碎片化及核皱缩等特征，同时细胞内促凋亡蛋白Bax和Caspase-3的活性显著上调[13]。抗氧化系统的失调促进了颗粒细胞的凋亡，加速了卵泡的闭锁[14]。Monirch Mahmoodi等人将小鼠卵巢异位移植至其臀大肌内，创造缺氧环境，并对野生型小鼠和卵巢异位移植鼠注射生理盐水或N-乙酰半胱氨酸。结果表明，异位移植鼠注射N-乙酰半胱氨酸后的卵巢体积较注射生理盐水组明显变大，并且卵泡总数目明显增多，同时闭锁卵泡数目及卵泡内戊二醛浓度(凋亡指标)明显减少，而雌二醇浓度显著升高，这表明N-乙酰半胱氨酸可通过降低卵巢组织的氧化应激和凋亡水平改善卵泡发育，提高卵泡的存活能力[15]。颗粒细胞分泌的环磷酸鸟苷、环磷酸腺苷及一氧化氮等信号分子可以保护卵母细胞免ROS的损伤[16]。总而言之，颗粒细胞的凋亡、氧化应激的增高导致了卵泡闭锁退化。

2 环氧合酶-2(COX-2)基因在卵泡发育中的作用

环氧合酶 (cyclooxygenase，COX) 是合成各种前列腺素 (prostaglandins，PGs )的关键酶。细胞膜中磷脂在磷脂酶A2 催化下释放出花生四烯酸，后者在COX催化下形成PGH2。PGH2又分别在相应PG异构酶作用下合成PGE、PGF、PGD、PGI等。COX家族包括组成型酶COX-1及诱导型酶COX-2两种同工酶。COX-1由管家基因编码，其作用主要是在多数组织中稳定表达，维持人体正常生理功能，如保护胃肠道、调节肾血流量等。COX-2为诱导型酶，主要分布在核膜，是排卵卵泡中前列腺素E2(PGE2 )合成的限速酶，在卵巢中主要在颗粒细胞中表达[17]。

前列腺素E2主要由颗粒细胞合成，是大多数哺乳类动物排卵卵泡中关键的调节分子，在诱导卵泡排卵、胚胎着床与发育过程中起着极其重要的角色[18]。哺乳动物排卵前，垂体释放大量的黄体生成素(LH)，称为LH排卵峰。LH峰能够刺激排卵前卵泡内的分泌功能发生剧烈的变化，当扩张的卵丘细胞达到足够数量时，卵泡破裂，COCs从卵泡壁脱离，将卵母细胞释放到输卵管中。排卵过程中，黄体生成激素激增，通过COX-2和前列腺素合酶诱导颗粒细胞合成PGE2。PGE2 释放到胞外后，通过结合卵丘颗粒细胞上PGE2 受体2和受体4，诱导MAPK磷酸化，增加细胞内cAMP水平，并激活蛋白激酶B和MAPK通路，促进排卵发生[19]。COX-2又称为排卵诱导因子及细胞凋亡的抑制因子，可以被有丝分裂素、细胞因子、肿瘤启动子和生长因子等诱导[20]。马丽珠在牛卵泡颗粒细胞中对COX-2基因的研究发现，随着卵泡的生长，COX-2基因表达在颗粒细胞中的表达显著上升[21]。在COX-2基因敲除的雌性小鼠中，尽管卵泡可以发育，但排卵数明显减少而且排出的卵子也几乎不能受孕，注射PGE2又可使排卵重新恢复正常[22]。在COX-2基因缺陷的雌性小鼠会出现多方面的生殖功能障碍，如排卵障碍、卵子受精率下降、胚胎着床及子宫蜕膜化障碍等[23]。这些结果表明COX-2基因及PGE2在卵泡发育过程中，抑制卵泡闭锁。

2.1 环氧合酶-2(COX-2)通过抑制细胞凋亡缓解卵泡闭锁

颗粒细胞凋亡直接或间接地介导了卵泡闭锁。研究卵巢癌细胞凋亡，结果显示COX-2 抑制剂可通过调节 caspase-3和caspase-9的表达来抑制细胞生长，促进细胞凋亡[24]。邓琳等的研究发现将慢病毒载体Lenti-COX-2-EGFP转染到卵巢癌细胞株SKOV3和ES2后，COX-2过表达，卵巢癌细胞的增殖和迁移能力增强，COX-2抑制剂塞来昔布则可抑制COX-2过表达细胞的增殖及迁移能力[25]。干扰COX-2表达水平，抑制卵巢癌细胞的生长，且是通过抑制肿瘤细胞凋亡来促进卵巢癌细胞生长[26]，说明COX-2与卵巢癌细胞的生长及凋亡有关。Bcl-2是较早发现的凋亡相关基因之一，能够延长细胞周期，抑制细胞凋亡，其蛋白产物是一种重要的抗凋亡蛋白，主要分布在内膜上，包括线粒体、核膜等，主要通过内源通路发挥抗细胞凋亡作用，Bcl-2的过表达可能导致细胞持续增殖，从而引起肿瘤发生。在刺槐素对卵巢细胞系SKOV3细胞增殖和凋亡的影响及作用机制的研究中发现，刺槐素可以通过抑制p-NF-κB、下调COX-2表达，继而上调促凋亡蛋白Bax表达、下调抗凋亡蛋白Bcl-2表达抑制SKOV3细胞的活力[27]。这些结果表明COX-2基因影响细胞凋亡，且发挥着重要作用。

2.2 环氧合酶-2(COX-2)缓解ROS升高引起的细胞凋亡

氧化应激可以通过激活死亡受体途径引起细胞凋亡，越来越多的研究揭示年龄引起的繁殖能力下降及停止，主要是由于氧化应激水平增加导致的。对老龄鼠和青年鼠卵巢氧化应激及繁殖力的研究发现，由氧化应激引起的卵巢衰老加快，且卵巢颗粒细胞凋亡率显著上升，而繁殖能力下降[28]。在对年轻和老龄的食蟹猕猴的卵巢进行单细胞测序发现，卵母细胞氧化应激及凋亡水平的增高是其繁殖机能下降的主要原因。用21～46岁人的颗粒细胞进行验证，发现随着年龄的增加，抗氧化基因IDH1、PRDX4和NDUFB10的表达水平下降[7]；同时在老龄妇女的颗粒细胞中发现SOD和CAT基因表达下降[29]，卵泡液中的GST和GAT活性也下降[30]。对蛋鸡不同产蛋期90 d、150 d、180 d的抗氧化基因进行比较发现，随着年龄的增加T-AOC、SOD、CAT的水平呈现明显下降的趋势，而丙二醛MDA和氧化自由基ROS水平逐渐上升，这和产蛋率的下降呈现极强的相关关系[31]。随着年龄增加，在许多哺乳动物的组织中，活性氧和自由基在线粒体中含量比率增高，对线粒体及其他细胞和组织产生氧化应激，造成生物大分子氧化损伤，从而推进衰老及繁殖技能衰退。过氧化物还原酶4(PRDX4)可以通过抗氧化应激机制促进卵泡发育成熟，抑制卵母细胞老化[32]。有研究显示，GPX1上调进而缓解氧化应激的同时，PGE2限速酶COX-2的表达也会随之上调，进而缓解氧化应激的损伤[33-34]。氧化应激的水平增高进而导致细胞凋亡，导致卵泡闭锁增加，目前COX-2基因抗氧化应激、细胞凋亡及卵泡闭锁的过程及机制研究还极其匮乏。

2.3 环氧合酶-2(COX-2)在PI3K/AKT/NOTCH/Wnt通路上的研究

PI3K/AKT信号通路是细胞增殖调控的重要通路之一，主要是通过促进细胞增殖来抗凋亡，PI3K被激活后动力激活AKT(pAKT)，AKT激活后磷酸化大量下游底物，可以通过调节mTOR/Raptor复合物1(mTORC1)的活性来调控蛋白质的合成，促进细胞增殖[35]，AKT通过抑制Caspase-9和Bcl-2家族成员失活等多种下游信号分子的磷酸化来阻断细胞凋亡。因此激活AKT不仅可以防止颗粒细胞的凋亡，而且还可以调节细胞增殖[36]。pAKT 也可以通过多重磷酸化作用灭活促凋亡蛋白或抑制叉头盒转录因子(FOXO家族，如FOXO3a)激活进而下调促凋亡蛋白(Bax)表达，促进细胞存活[37]，在卵泡发育成熟过程中调控颗粒细胞的生长和凋亡发挥了重要的作用[38]。NF-kB是PI3K/AKT信号通路的下游主要效应子，很多研究表明激活PI3K/AKT/ NF-kB可以增强细胞的存活及抗凋亡能力[39-40]。Notch信号通路在在癌症中可以通过Bcl-2介导细胞增殖和抗凋亡能力[41]，也可以和PI3K/AKT、TGFβ、NF-kB、Wnt、雌激素受体信号通路形成交叉对话，同时这些分子及信号通路对Notch信号通路具有重要调节作用，进而可以对颗粒细胞的凋亡进行调节。Wnt/β-Catenin信号通路通常分为经典的β-连环蛋白(β-Catenin)依赖性途径和非依赖性途径，没有Wnt配体的情况下，Wnt/β-Catenin信号通路处于失活状态，对细胞的增殖存活以及干细胞的自我更新和分化方面有重要的作用[42]。以上结果证实，以上分子、信号通路参与细胞凋亡、增殖过程，并起着重要作用。

有研究发现，在肝癌细胞中，姜黄素可能通过PI3K/AKT/mTOR信号传导通路抑制人肝癌细胞BEL-7402中COX-2的表达，抑制细胞的增殖[43]。在TGF-β1诱导的人胚肺成纤维细胞系MRC-5研究中，结果揭示抑制COX-2基因表达可通过降低MRC-5细胞活力、抑制细胞胶原合成和转化，并下调Notch信号通路，从而对肺纤维化起保护作用[44]。在子宫肌瘤细胞的研究中，环氧合酶-2(COX-2)选择性抑制剂塞来昔布(celecoxib) 通过Wnt信号通路抑制肌瘤细胞的增殖[45]。在肉骨瘤的研究中发现，将高表达COX-2基因的MG63细胞用PI3K抑制剂LY294002、Notch抑制剂 LY411575以及Wnt抑制剂IWP-2分别单独抑制相关通路后，均可产生抑制COX-2的效果。同时也发现了COX-2及PI3K蛋白活性的抑制可以导致p-PI3K、NOTCH及Wnt蛋白含量下降。这些结果提示COX-2、PI3K、Notch以及Wnt分子之间/信号通路之间存在相互对话或关系。

3 结语

在成年雌性动物体内，随着卵泡的生长颗粒细胞中COX-2基因表达上升。颗粒细胞的凋亡是卵泡闭锁的主要原因，因此推测COX-2基因在卵泡颗粒细胞中可能通过抑制颗粒细胞的凋亡，维持卵泡的生长及优势化，进而作为排卵诱导因子诱导排卵，COX-2通过PI3K/AKT、Notch、Wnt信号通路对细胞增殖的维持与抗凋亡发挥作用均有相关报道，但这些分子之间可能存在某种顺序调控及交叉对话，其相关报道较少。今后对COX-2的研究重点可放在其通过PI3K/AKT/Notch/Wnt信号通路维持颗粒细胞生长、抑制凋亡，进而研究其诱导排卵的串联机制。