幼龄反刍动物胃肠道发育与微生物演变及其调控

2021-12-05郭芸芳徐晓锋张力莉

中国饲料 2021年23期

郭芸芳，徐晓锋，张力莉

（宁夏大学农学院，宁夏银川 750021）

瘤胃是反刍动物最重要的消化器官，饲料营养物质在瘤胃内消化通过瘤胃上皮吸收，未被瘤胃消化的营养物质在小肠内进一步被消化吸收。因此，胃肠道发育对反刍动物的生长、生产性能和健康起着关键作用；胃肠道微生物对营养物质消化吸收、代谢和胃肠道发育方面的作用也是不可忽视的；由于幼犊牛免疫力差，消化系统发育不完全，任何外部环境的干扰或营养水平的变化都会影响犊牛的发育（Diao，2017）和微生物区系的建立；同时越来越多的研究表明，胃肠道微生物群在黏膜免疫系统的发育中起着至关重要的作用（Malmuthuge，2015），而幼龄是反刍动物胃肠道发育及微生物区系建立的关键时期，因此了解并根据幼龄反刍动物年龄阶段来采取相关调控策略对生产实践有重要意义。

1 幼龄反刍动物胃肠道发育的规律

反刍动物与单胃动物的主要区别在于具有庞大的复胃消化系统，瘤胃在出生时尚未发育，随着日龄的增长和饲粮及饲养管理的影响，使胃肠道的发育呈现一定规律；因此，深入了解胃肠道的发育状态对于动物营养物质消化吸收、健康和生产性能都尤为重要。

1.1 瘤胃容积发育变化犊牛出生时，网胃、瓣胃和皱胃的重量分别占整个胃重量的38%、13%和49%，随着日龄的增长，瘤胃重量占比增加，并成为消化营养物质的主要场所（Davis，1998）。瘤胃发育一般为3 个阶段：0 ~ 3 周龄为非反刍阶段；3 ~ 8 周龄为过渡阶段；8 周龄时瘤胃发育完全，进入反刍阶段（Lane，2002）。研究表明，犊牛早在胚胎时期胃肠道开始发育，瘤胃、网胃、瓣胃和皱胃在母畜妊娠56 日龄时已经基本成形（邓由飞，2017）；犊牛消化功能在胎儿时期发育，出生48 h 内，由于与母体分离以及饲喂初乳，使胃肠道形态和菌群变化较大，哺乳期幼畜的消化功能从消化鲜奶或流体饲料向固体饲料过渡，这期间瘤胃和网胃快速发育，重量占比增加（Guilloteau，2009）。羔羊瘤胃重量、肌层厚度和乳头长度随日龄的增长而增加，在70 日龄时趋于稳定，而瘤胃乳头数量在14 ~ 28 日龄时显著降低，在0 ~ 70日龄，放牧山羊的瘤胃乳头面积比补饲山羊的瘤胃乳头面积增长速度更快（Jiao，2015）。王佳堃等（2020）研究表明，瘤胃发育成熟的标志是丙酸等生酮物质含量增加；常用血浆中β–羟丁酸含量来说明瘤胃发育的状态。研究表明，犊牛皱胃重量相对于体重变化不大，但皱胃黏膜重量在妊娠最后一个月增加25%，在出生2 ~ 7 日龄显著增加20% ~ 30%（Guilloteau，1984）。

1.2 瘤胃上皮与肌肉层的发育瘤胃上皮的发育是由瘤胃微生物群和宿主之间相互作用引起的，并随着饲粮而发展变化（Malmuthuge，2017）；研究表明，10 周龄内羔羊瘤胃乳头长度和乳头表面发生了显著变化，1 ~ 4 周龄羔羊瘤胃乳头表面较光滑，瘤胃上皮细胞发育程度较低，6 ~ 10 周龄羔羊瘤胃乳头长度增加，瘤胃上皮明显增厚且粗糙（Zitnan，1993）。张科等（2017）研究发现，羔羊采食粗饲料后，瘤胃背囊乳头高度和宽度随着日龄的增加均呈现出增高或增宽的趋势，瘤胃肌层逐步增厚；角化层从42 日龄开始出现，皱胃黏膜层厚和皱胃肌层厚没有明显变化规律。值得注意的是，羔羊采食开食料显著提高了瘤胃乳头的长度和宽度，改变了瘤胃发酵参数，可能是由于饲料进入瘤胃后，刺激生酮能力和丁酸代谢，从而促进了瘤胃乳头的发育（Wang，2016）。卢劲晔等（2018）给90 ~ 120 日龄波尔山羊每天饲喂精料400 g，持续42 d，结果表明，饲粮添加精料可加速瘤胃上皮细胞增殖，促进瘤胃上皮细胞生长，阻滞瓣胃上皮细胞增殖，抑制瓣胃上皮细胞生长。饲粮中添加苜蓿干草或起始料，促进了牦牛犊牛的胃肠道发育，原因可能是干物质采食改变了瘤胃发酵状态，使得瘤胃丁酸浓度升高，瘤胃产丁酸菌的数量增加，因此，可进一步促进瘤胃上皮的发育，但因两种饲粮成分不同，其瘤胃丁酸产量也有差异（Wu，2021）。犊牛出生 5 周龄内无限量或限量饲喂代乳品，两组瘤胃上皮的表面积无明显差异，瘤胃pH 和挥发性脂肪酸浓度不受代乳品饲喂量的影响代乳品与起始料配合饲喂，可以增加犊牛瘤胃上皮重量，瘤胃乳头表面积也显著增加，同时增加肠道基底细胞的增殖率（Yohe，2019）。断奶前舍饲有利于牦牛的胃肠发育及消化吸收，瘤胃上皮乳头的长度和宽度均显著升高，而瘤胃基底层厚度未受影响（Jonova，2021）。研究表明，长期饲喂高谷物饲粮会改变奶牛和绵羊的瘤胃发酵以及瘤胃和瘤胃上皮相关的微生物群，并导致瘤胃损伤和代谢紊乱（Hua，2017）。

1.3 肠道发育肠黏膜的发育遵循近端-远端的模式，即隐窝和绒毛首先出现在十二指肠，然后逐渐出现在肠道的更远端（Toofanian，1976）。张科等（2017）研究了0 ~ 56 日龄羔羊胃肠道组织形态随日龄的发育变化规律，发现小肠和大肠的重量随着日龄的增长而增加，小肠各段的绒毛高度/隐窝深度随日龄增长而降低，结肠在整个阶段发育最快。饲料过渡期间，营养物质和物理形态均发生变化，肠道变化表现为微绒毛变短，后肠重量占比降低，为营养物质的消化吸收做好形态学的准备（Guilloteau，2009）。 14 ~ 21 日龄时羔羊盲肠相对质量增速最快，其次为42 ~ 56 日龄，各阶段小肠相对质量增速波动较小，56 日龄时大约增加了1倍（王彩莲，2010）。以 30 日龄的牦牛犊牛作为研究对象，发现与放牧方式相比，代乳品+补饲的培育方式更有利于牦牛犊牛小肠上皮组织形态发育，并增强了小肠部分消化酶的分泌能力，如α淀粉酶和胰蛋白酶（崔占鸿，2020）。研究发现，舍饲更有利于牦牛犊牛肠道发育，显著增加了牦牛犊牛十二指肠、空肠、回肠的绒毛高度和隐窝深度，但十二指肠脂肪酶、空肠脂肪酶和回肠脂肪酶显著降低（Hua，2017）。

幼龄反刍动物的胃肠道发育随日龄呈现一定的规律，是由胃肠道微生物及其代谢产物、饲粮和宿主之间共同作用的结果，幼龄反刍动物胃肠道发育程度直接影响成年动物的生产性能和营养物质的利用率。

2 幼龄反刍动物胃肠道微生物区系的演变

胃肠道微生物定植是一个复杂的过程，分娩时与母体分离以及出生后与外界环境接触都为微生物定植提供了一定条件；幼龄反刍动物胃肠道微生物区系的丰富度和多样性处于不断变化的状态，这些微生物与宿主相互作用，有利于营养物质的消化吸收和生产性能的发挥；所以了解幼龄动物胃肠道微生物区系的演变规律，为幼龄动物生产潜力的挖掘有重要意义。

2.1 瘤胃微生物区系的变化有研究表明，反刍动物的胃肠道，包括前胃复合体，在出生时是无菌的，但在最初的24 h 内迅速定植，厌氧菌在出生后第二天开始占优势（Fonty，1989）。但也有研究表明，在产前羔羊肠道中检测到一个低多样性、低生物量的微生物组，主要由变形菌门、放线菌门和厚壁菌门组成，产前胎儿肠道中大肠杆菌的数量最多，说明产前肠道含有微生物，并且胎儿肠道的微生物定植开始于子宫（Bi，2021）。Rey（2014）和 Jimi（2013）等研究表明，犊牛瘤胃细菌群落在出生后迅速形成，瘤胃内群落由成熟瘤胃中发现的许多细菌组成，在门水平上，1 ~ 3 日龄犊牛瘤胃中最丰富的菌门是变形菌门；在属水平上，3 ~ 12 日龄时瘤胃优势菌属为拟杆菌属、普雷沃氏菌属、梭杆菌属和链球菌属，当固体摄食量迅速增加时，普雷沃氏菌属占有主导地位，许多属急剧减少或不再被检测到（Rey，2014）。研究发现，瘤胃微生物的多样性和总物种的丰度随年龄的增长而增加，所有年龄阶段的优势菌门主要由拟杆菌门、厚壁菌门和变形菌门组成，厚壁菌门在所有年龄阶段中都稳定存在，而拟杆菌门和变形菌门的相对丰度发生了变化（Wang，2016；Koenig，2011）。 Li 等（2011）研究表明，大多数瘤胃细菌如蛋白质分解菌、纤维素分解菌和其他种类细菌在4 ~ 10 日龄羔羊的瘤胃微生物区系中即定植。

瘤胃微生物群落在不同年龄阶段会发生一定变化，其中细菌和古菌比其他微生物群对年龄的变化更敏感；细菌、古菌、原虫和真菌在牦牛生长过程中都有相对应的成熟轨迹，其中瘤胃古菌大约在牦牛5 岁时完全成熟，而其他微生物群在5~ 8 岁成熟（Wei，2020）。

以上研究结果表明，幼龄反刍动物出生前肠道内已经有微生物存在，在出生几天内便可以检测到成熟瘤胃中的细菌、古菌和真菌分类群；可以看出，细菌为各个年龄阶段的优势类群，主要由拟杆菌门、厚壁菌门和变形菌门组成，但在不同年龄阶段所占比例不同；在属水平上，普雷沃氏菌属丰度随着日龄增长而增加。

2.2 肠道微生物区系的变化肠道细菌多样性从出生到2.5 岁逐渐增加，与群落多样性的逐渐变化有关（Jiao，2015）；新生犊牛出生一周的小肠腔内微生物群由细菌、古菌、真菌、原生动物和病毒组成，在犊牛的所有肠区都可以观察到厚壁菌门、拟杆菌门、变形菌门和放线菌门（Malmuthuge，2019）。

Li 等（2019）对 0 ~ 56 日龄山羊的胃肠道细菌群落动态进行研究，发现随着年龄的增长，大肠中的变形菌门被厚壁菌门取代，而变形菌门主要存在于日龄较大的山羊小肠中，乳杆菌属在14 日龄山羊空肠和回肠中急剧增加；年龄较大的山羊十二指肠和空肠中，乳杆菌属和拟杆菌属的比例较低，而Christensenellaceae_R_7 和反刍球菌属的比例较高。 Song 等（2018）研究表明，后肠微生物群在出生时具有多样性，黏膜附着微生物群比消化相关微生物群具有更高的个体差异，共鉴定出16 个门，厚壁菌门、拟杆菌门和变形菌门是后肠的优势菌群；PCR 分析结果显示，年龄对黏膜附着大肠杆菌、双歧杆菌、粪肠球菌的比例有显著影响；尤其在出生后第一周检测到大量的黏膜相关埃希氏菌，表明在此阶段致病感染的可能性更高。新生犊牛后肠的优势菌科包括拟杆菌科、毛螺菌科、乳杆菌科和肠杆菌科（Frese，2015）。 Kimberly等（2017）研究了犊牛粪便微生物群落，发现断奶前犊牛粪便细菌群落在OTU 水平上有很高的β多样性；随着犊牛年龄的增长，粪便中的许多细菌OTUs 数量逐渐减少，并在成年后消失，这些OTU大多是糖溶性属，包括乳杆菌（Lactobacillu）和产丁酸的粪便杆菌（Faecalibacterium），这些细菌可能有助于胃肠发育。可以看出，肠道微生物群与瘤胃内菌群相似，随年龄而变化，不同年龄阶段优势菌门的丰度存在差异，不同肠段的菌属丰度也存在差异。

3 幼龄反刍动物胃肠道发育与菌群调控

促进反刍动物胃肠道发育与微生物定植的方法有很多，比如饲粮形态及营养水平、添加剂、饲养管理方式以及微生物移植等，通过这些调控措施可以改变胃肠道发育程度并改善动物的健康状态；近年来，有许多关于营养、管理以及微生物移植等方式来直接调控幼龄动物胃肠道发育及微生物区系的相关研究，并具有一定的效果。

3.1 饲粮形态及营养水平有报道称，无论饲粮如何，7 日龄犊牛瘤胃中已经建立了成熟瘤胃中常见的古细菌、细菌和真菌分类群，液体饲粮饲喂的犊牛瘤胃中乳杆菌、拟杆菌和Parabacteroides等菌属的丰度较高（Dias，2017）。有学者研究了饲喂代乳粉对羔羊的微生物区系建立的影响，发现代乳粉组羔羊瘤胃微生物区系的变化明显，其中拟杆菌门成为优势菌门，琥珀酸菌属、瘤胃杆菌属等在25 日龄后相对丰度高于哺乳组，乳酸杆菌属相对丰度在 45 日龄后逐渐升高，相反，在25日龄后韦荣氏球菌属（Veillonella）相对丰度明显下降（李永洙，2019）。

羔羊补饲开食料，增加了瘤胃挥发性脂肪酸产量，改变了瘤胃发酵和瘤胃微生物群落，表现为普雷沃氏菌属和毛螺菌科相对丰度显著升高，以上两者可能是添加开食料而引起瘤胃功能变化的主要微生物（Lv，2019）。研究表明，饲粮脂肪水平会影响瘤胃发酵参数，羔羊60 日龄时饲喂高脂肪饲粮，瘤胃中变形菌门和纤维杆菌门丰度升高；属水平上，琥珀酸弧菌属、拟普雷沃氏菌属等细菌丰度显著升高，但罗氏菌属、梭菌属、小类杆菌属和丁酸弧菌等菌属丰度显著降低（李文娟，2018）。因此，饲粮形态及营养水平会改变瘤胃菌群丰度，饲粮代谢产物也会改变瘤胃发酵参数，以上两者因素共同作用来影响瘤胃菌群的建立和瘤胃发育。

3.2 添加剂犊牛饲粮中添加鼠李糖乳杆菌GG（GG，ATCC 53013）提高了新生犊牛的主动采食量和生长性能，调节了瘤胃发酵模式，使丙酸盐和丁酸盐的浓度增加，提高了瘤胃液中淀粉酶、蛋白酶活性和微生物蛋白浓度，还使瘤胃内的细菌群落组成多样化，并调节瘤胃和肠道微生物的平衡（Zhang，2019）。犊牛饲粮补充酿酒酵母及培养物增加了瘤胃乳头长度，空肠隐窝深度降低，小肠绒毛高度与隐窝深度的比率增加，并提高丁酸弧菌的相对丰度，降低普雷沃氏菌相对丰度（Xiao，2016）。补饲丁酸钠可以提高羔羊瘤胃液中乙酸、丁酸和总挥发性脂肪酸的浓度，增加瘤胃乳头长度、宽度以及角质层和总上皮的厚度（Liu，2019）。

以上研究说明，在幼龄动物饲粮中添加一些微生态制剂、发酵剂或酸化剂可以改变瘤胃发酵模式，从而改变瘤胃代谢，促进瘤胃发育和微生物的定植，还能改变部分微生物区系的丰度。

3.3 饲养管理方式 Abecia 等（2014）选择了怀双羔的妊娠母羊，羔羊出生后，分别用母乳和人工代乳品喂养，发现母乳喂养的羔羊瘤胃重量更高，而两组的瘤胃内容物体积则没有差异，两组羔羊均在出生第一天瘤胃内检测到细菌、古菌和原虫的存在；原虫和螺旋菌门（Spirulina）在母乳喂养的羔羊瘤胃中逐渐增加，而在另一组中没有变化，说明饲养管理（自然和人工）对微生物定植和瘤胃发育有影响。有学者研究了不同饲养方式对12 月龄苏尼特羊胃肠道菌群结构的差异，结果表明，放牧组苏尼特羊胃肠道菌群的α 多样性显著高于舍饲组，放牧组胃肠道菌群中厚壁菌门的相对丰度高于舍饲组，而变形菌门的相对丰度低于舍饲组。放牧组瘤胃中普氏菌属、RC9-gut-group、拟杆菌属、丁酸弧菌属和Quinella 属的相对丰度高于舍饲组;而舍饲组中琥珀酸弧菌属的数量最多。放牧组肠道中拟杆菌属、RC9-gut-group 和Alisties的相对丰度高于舍饲组（王柏辉，2019）。上述研究表明，不同饲喂方式和管理条件会影响胃肠道发育和微生物区系的建立以及菌群的相对丰度。

3.4 微生物移植目前关于微生物移植相关报道有瘤胃微生物移植（RMT）和粪菌移植（FMT），是指将健康供体的瘤胃微生物或粪便微生物移植到受体牛胃肠道内，来调节肠道菌群平衡，促进胃肠发育并帮助治疗胃肠道疾病。

研究表明，通过给新生犊牛灌服健康成年牛的瘤胃液，改变了瘤胃和盲肠乙酸与丙酸的比例，十二指肠的绒毛高度增加，并改善了犊牛早期腹泻的发病率（张鑫，2017）。有学者给幼龄山羊重复接种成年山羊的新鲜瘤胃液，发现接种瘤胃液加速了瘤胃微生物的定植，与未接种的山羊相比观察到更高的细菌多样性（+ 234 OTUs）、产甲烷菌（+6 OTUs）和原虫群落（+25 OTUs）；该研究还发现高压灭菌瘤胃液的接种也促进了瘤胃功能的发育，但使用效果不如新鲜瘤胃液明显（Palma-hidalgo，2021），可能是高压灭菌过程中影响了部分有益菌的活性。 Kim 等（2021）研究发现，FMT 之后犊牛肠道微生物群落结构逐渐类似于供体小牛的结构，相关分析表明，肠杆菌科细菌丰度异常增加所表现的肠道菌群失调极有可能引发幼犊腹泻，肠杆菌科与卟啉单胞菌科相对丰度呈负相关，而FMT 后肠道微生物区系成熟，以卟啉单胞菌科的丰度增加为特征，限制了肠杆菌科种群的扩张，所以FMT 可以改变微生物群落并降低犊牛腹泻的发病率。

可以看出RMT 或FMT 能够促进胃肠道发育和微生物区系的变化，并改善幼龄动物的腹泻发病率，但目前关于FMT 在反刍动物上的研究较少；此外，关于这两种移植技术的样品前处理、移植剂量、移植细节，对动物身体机能的影响，以及这种移植可能在改善动物生长性能方面发挥的潜在作用还值得进一步研究。