环状RNA在动物肌肉发育中的研究进展

杨丽丽，张琼文，张其伟，陈 婷，江明生

(广西大学动物科学技术学院，广西 南宁 530000)

0 引言

环状RNA是从lncRNA分离出的一种新的非编码RNA，在真核生物中高度表达。环状RNA的结构极其稳定，不同于lncRNA、miRNA的结构，lncRNA、miRNA具有游离的5′端帽子结构和 3′端 Poly(A)尾巴结构，而circRNA是5′端和3′端连接在一起，形成一个环状RNA。通过mRNA前体剪接形成，由内含子或外显子或内含子-外显子环化产生，不同的环化方式，其功能作用不同。在后生动物中，环状RNA以组织特异性的方式表达。过去的几十年，环状RNA被认为是剪接的副产品，无任何价值、没有功能作用。但近10年来的研究发现，环状RNA不但有用，而且在生物体中参与生物体的各种生命活动，如参与机体的正常生理活动、Wnt信号通路、机体代谢通路的调控，发挥着重要作用。最近几年，随着RNA测序技术的发展，生物信息学工具的出现、不断更新、完善，环状RNA进入RNA的研究前沿，环状RNA的研究越来越多。

1 环状RNA的生物学特性

1.1 环状RNA的起源

1976年，sanger和他的同事在植物类病毒中发现了环状RNA[1]。1992年，在人类中发现竞争性內源RNA，被称为杂化外显子[2]。1993年，Cocquerelle和他的同事研究确定了将这种带有杂化外显子的非聚腺苷化RNA确定为共价封闭环状RNA，同时研究还证明环状RNA定位于细胞质中[3]；同年Capel的研究表明环状RNA主要在细胞质中，具有组织特异性[4]。2010年开始，随着RNA测序技术的发展和生物信息学工具的出现，circRNA的研究进入前沿。2010年的几项研究表明，数千种环状RNA在后生动物中表达[5-8]，尽管大多数circRNA表达水平低，但有些却很丰富。20世纪90年代，在高等真核生物中表达的第一个内源性环状RNA才被鉴定出来[9]。随着高通量RNA测序技术的进一步发展，显示环状RNA广泛表达于各种生物体、发育阶段和组织中[5-7，10]。

1.2 环状RNA的形成机制

环状RNA是一类共价闭合环状RNA。1987年，Price和他的同事的研究发现circRNA通过反向剪接将下游5′端剪接位点连接到上游3′端位点[11]，形成环状RNA。随后，Kjems的研究发现环状RNA是由单细胞真核生物中的剪接内含子和古菌中的核糖体内含子产生的[12]。2016年2月份，有研究表示真核细胞中的circRNA来源于mRNA前体(pre-mRNA)的反向剪接而成。与线性剪接相比，反向剪接的剪接效率慢[13]。2017年，Piwecka M和Conn VM的研究，发现环状RNA的产生通常是由内含子重复序列促进的，内含子重复序列彼此碱基配对，使插入的剪接位点接近[14，15]，这类环状RNA为内含子环状RNA[16]。之后，有相关研究报道，包括Quaking 1(QKI)、muscleblind(MBL)、FUS和nuclear factor 90(NF90)在内的RBPs通过与侧位内含子结合配对，促进外显子序列的循环[17]，这类环状RNA为外显子环状RNA[7]。Zhang等人最近的一项研究表明，备用的5′供体剪接位点和3′受体剪接位点可以从单个基因座产生多个环状RNA[18]，这类环状RNA为外显子-内含子(EI)环状RNA[19]。

2 环状RNA基本功能

早前研究，发现了大量环状RNA。最初，研究者发现其是剪接的副产品，被认为是无功能的。随着RNA-seq和生物学信息的发展，越来越多的环状RNA被发现具有潜在功能，最近的研究证明环状RNA在生物机体、后生动物中起多种作用。环状RNA主要有以下4种基本功能。

2.1 作为竞争性內源RNA

通过结合miRNA而抑制miRNA的功能。环状RNA中存在miRNA的多个结合位点，存在竞争关系，调控miRNA下游靶基因的表达。2016年，yang和他的同事研究表明，ciRS-7具有miR-7的74个miRNA结合位点，当ciRS-7过表达时，能大量结合miR-7而导致miR-7靶基因表达水平上升，相反，抑制ciRS-7的表达时，miR-7靶基因表达水平降低[20，21]。这个例子就很好地证明circRNA具有多个miRNA的结合位点，同时能调节多个miRNA的活性。

2.2 转录和剪接的调节因子

在细胞核内参与转录调控，通过与mRNA异构体竞争性剪切从而调控线性mRNA的表达水平[22]。研究报道，Ci-ANKRD52和ci-SIRT7可以通过与RNA PoI II相互作用调控转录水平[23]。Li的研究结果证实单个基因座产生的环状RNA为外显子-内含子(EI)环状RNA或EIciRNA，EIciRNA主要位于细胞核内，Shan等人研究证明，EIciRNA在细胞核中，与U1 snRNP相互作用并促进其亲本基因的转录[24]。

2.3 与RNA结合蛋白结合

研究报道，环状RNA可以与某些RNA结合蛋白，作为蛋白质与蛋白质之间相互调节的支架分子影响蛋白的表达[25]，从而调控蛋白的功能。有研究证明，circ-Foxo3可结合NDM2和p53，促进p53泛素化修饰和降解，导致细胞PUMA上调增加细胞凋亡敏感性[26]；circ-Foxo3通过与细胞周期蛋白依赖性激酶2(也称为细胞分裂蛋白激酶2或CDK2)和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1(或p21)结合而抑制了细胞周期进程三元复合体。CDK2与细胞周期蛋白A和细胞周期蛋白E相互作用以促进细胞周期进入，而p21则抑制这些相互作用并阻止细胞周期进程[27]。

2.4 环状RNA具有编码潜能

早期研究报道，环状RNA不能翻译蛋白。但随着技术的发展，有研究证明具有核糖体进入位点序列(IRES)的circRNA具有编码潜能，环状RNA通过与核糖体相互作用，参与蛋白的翻译。2017年，Legnini的研究表明，circ-ZNF609可以翻译蛋白并调控肌肉发育，Circ-ZNF609包含一个从起始密码子开始的可读框，与线性转录本相同，并终止于在环化过程中创建的帧内STOP密码子，circ-ZNF609与重链多核糖体相关，并以剪接依赖性和帽依赖性的方式翻译成蛋白质[28]。2017年Pamudurti的研究证实circ-Mb1可以翻译蛋白质，2018年陈雅露的文章提到的研究结果证实circ-FBXW7具有翻译功能[29]。

3 环状RNA调控动物肌肉发育

已有多项研究报告了环状RNA在医学疾病、肌肉发育中的生物学功能，环状RNA可以结合miRNA而抑制miRNA的功能，即环状RNA可海绵化miRNA；环状RNA可以在细胞核内，调控mRNA的表达水平；环状RNA也可以调控蛋白，通过与RNA结合蛋白结合，影响蛋白结构；环状RNA具有编码功能，但是，相关研究报道较少。在动物肌肉发育中研究较多的是环状RNA的竞争性内源作用。

3.1 circ RNA-RBFOX2、circSVIL、 circFGFR2调控鸡肌肉发育

为了探究circRNA鸡骨骼肌发育中的机制，Ouyang 等[30，31]对鸡3个发育时期(胚胎11 d，胚胎16 d和出生后1 d)腿肌的circ RNAs进行转录组测序分析，共鉴定13，377个circ RNAs，其中3，036个表达丰度较高，462个呈显著性差异表达，在946个外显子circ RNAs中发现有150个已知的miRNA的结合位点。进一步分析 circ RNA -RBFOX2和circSVIL在鸡骨骼肌中的调控作用。circ RNA -RBFOX2具有miR-206和miR-1a-3p的结合位点。通过双荧光素酶报告实验检测发现，在circ RNA -RBFOX2存在的条件下，miR-206和miR-1a-3p敲低能力显著下降，接着通过circ RNA -RBFOX2过表达或敲低，qRT-PCR检测发现，circ RNA -RBFOX2过表达，miR-206和miR-1a-3p的表达水平下降，反之上升。为了进一步验证circ RNA -RBFOX2是否调控miR-206的靶基因，根据软件预测，荧光素酶检测，CCND2定为miR-206的靶基因。最后通过过表达敲低，发现CCND2是miR-206的靶点，并且随着circ RNA -RBFOX2过表达而上升。circSVIL来源于鸡2号染色体上SVIL外显子6-14，Ouyang研究发现CircSVIL在鸡的胚胎发育后期高表达，circSVIL有4个miR-203的结合位点，通过双荧光素酶报告试验验证了circSVIL与miR-203的相互作用[31]。结果证明，circSVIL通过使miR-203海绵化并增加靶标c-JUN和MEF2C的表达来促进成肌细胞增殖和分化。总之，circSVIL通过螯合鸡中的miR-203来促进胚胎骨骼肌的发育，circ RNA -RBFOX2通过海绵化miR-206增强CCND2的表达，促进了鸡成肌细胞的增值。以上研究为环状RNA在鸡育种调控机制中提供了新的理论知识。

circFGFR2是由FGFR2外显子3-6产生的基因，在鸡胚骨骼肌发育中差异表达。为了解circFGFR2是如何影响鸡骨骼肌发育的机制。Chen等[32]人通过细胞周期的流式细胞术分析和EdU分析来分析细胞增殖，通过分析分化标志物基因的表达和肌球蛋白重链(MyHC)免疫荧光来确定细胞分化。流式细胞仪分析细胞周期和EdU分析的结果表明，circFGFR2的过表达加速了成肌细胞和QM-7细胞的增殖，而用siRNA敲除circFGFR2则降低了这2种细胞的增殖。同时，circFGFR2的过表达加速了肌原性分化1(MYOD)，肌生成素(MYOG)和肌管的形成以及circFGFR2的敲低在成肌细胞中显示出相反的作用。荧光素酶报告基因检测和生物素偶联的miRNA下拉检测的结果进一步表明，circFGFR2可以直接靶向miR-133a-5p的两个结合位点和miR-29b-1-5p的一个结合位点，并进一步抑这两个miRNA。此外，有研究证实，miR-133a-5p和miR-29b-1-5p均抑制成肌细胞的增殖和分化，而circFGFR2可以消除两个miRNA的抑制作用。综上，circFGFR2通过使miR-133a-5p和miR-29b-1-5p海绵化，可以促进骨骼肌的增殖和分化。

3.2 circFGFR4、circFUT10、circLMO7、circTTN调控牛肌肉发育

Li等[33，34]分析了秦川牛胚胎时期和成年时期牛肌肉组织中差异表达的circFGFR4、circFUT10。为了探究其在肌肉中的调控机制，通过TargetScan 和RNAhybird软件预测circFGFR4、circFUT10的靶向基因miR-107、miR-133a，双荧光素酶报告实验检测其相互作用，实时荧光定量和WB检测表达量，观察到circFGFR4海绵miR-107，circFGFR4的过度表达增加了Wnt3a的表达，而这种效应被miR-107所消除；circFUT10通过直接结合miR-133a和抑制miR-133a的活性来调节成肌细胞的分化和细胞存活。综上，circFUT10、circFGFR4的表达在肌肉组织中的调节可能成为控制牛肌肉发育的育种策略的潜在目标。

Wei[35]为了探究circLMO7在牛肌肉发育中的功能，对其进行了鉴定分析。首先通过实时荧光定量PCR检测了circLMO7在不同组织中的表达，构建了组织表达谱，发现circLMO7在背肌中表达量最高。接着探究了circLMO7在肌肉发育中的功能机制，发现circLMO7的过度表达抑制了牛原代成肌细胞的分化，它似乎是miR-378a-3p的竞争性内源性RNA，MiR-378 a-3p参与牛肌肉发育的作用已被预先表征。这与研究者预期的结果一致，circLMO7在细胞周期的S期增加了成肌细胞的数量，在G0/G1期减少了细胞的比例。此外，它促进成肌细胞的增殖并保护它们免于凋亡。这项研究为骨骼肌发育的调控机制提供了新的见解，并确定了一些未来需要探索其调控潜力的环状RNA。

2019年，Xiaogang Wang[36]证明了circTTN在牛原代成肌细胞中的作用和调控机制。他们的研究首次确定了circTTN通过与miR-432作为ceRNA竞争来调节牛成肌细胞的增殖和分化，从而激活IGF2/PI3K/AKT信号通路。circTTN过表达促进牛原代成肌细胞增殖，干扰circTTN表达时，促进牛原代成肌细胞分化。通过荧光素酶筛选和RNA免疫沉淀(RIP)分析，证实了circTTN与miR-432的相互作用。定量实时聚合酶链反应和蛋白质印迹分析，结果发现miR-432表达的增加抑制了IGF2的表达，但这种作用被circTTN所缓解。

3.3 circTUT7调控猪肌肉发育

Hong L等研究了杜洛克猪在性交后第33、65和90 天胚胎肌肉发育中circRNA表达[37]。分析表明circRNA在胚胎肌肉发育中特异性表达。对circRNA的竞争性内源RNA(ceRNA)网络分析表明，circRNA调节肌肉通过充当miRNA海绵来表达基因，circTUT7在ceRNA机制中调节HMG20B的表达。试验表明，circRNAs是动态表达，并通过ceRNA方式与肌肉基因相互作用，提示其在胚胎骨骼肌发育中的关键功能。

3.4 circPAPD、circQKI调控羊肌肉发育

赵薇博士[38]在山羊背最长肌6个发育时期鉴定出了14 655个circRNA，6 276个circRNA在6个发育阶段共表达，有1 336个circRNA在不同发育阶段两两之间存在显著性差异。通过RT-PCR和qPCR验证了RNA-seq得到的circRNA的环化位点和表达量，证实了测序的可靠性。通过靶基因预测发现与circRNA结合的miRNA包含miR-1、miR-206和miR-133等肌肉特异性的miRNA，说明circRNA可作为miRNA的分子海绵参与肌肉发育过程，利用GO和KEGG富集分析发现，circPAPD7、circQKI参与细胞增殖分化过程。为进一步研究其功能，通过构建过表达载体和siRNA载体对其进行验证。结果发现，在SMSCs中过表达circPAPD7能极显著上调增殖相关基因PCNA、Pax7以及miR-26a-5p靶基因EZH2的表达并促进细胞增殖，同时过表达circPAPD7显著下调成肌分化相关基因MyoD、MyoG、Myomaker、MyHC和miR-26a-5p的表达并抑制肌管形成；抑制circPAPD7的表达则导致增殖相关基因及EZH2的表达下调并抑制细胞增殖，同时成肌分化相关基因及miR-26a-5p的表达上调且肌管数增多。通过AgO2-RIP实验进一步验证circPAPD7、miR-26a-5p及EZH2可通过ceRNA机制促进山羊SMSCs的增殖并抑制分化。过表达circQKI后增殖相关基因PCNA和Pax7、成肌分化相关基因MyoD、MyoG、Myomaker、MyHC和来源基因QKI的表达均极显著上调并促进细胞增殖以及肌管的形成；抑制细胞内源性circQKI的表达后，上述增殖、分化基因及来源基因QKI的表达均下调，同时新增细胞核及肌管数目减少。试验证明可通过上调circQKI基因的表达促进山羊SMSCs的增殖和分化。

4 发展前景

2010年起，RNA测序技术的进步，生物信息学方法的完善，大量环状RNA被发现，被收入数据库，意味着环状RNA的研究有了新的发展，而不是被认为无功能的剪接副产品。近几年，环状RNA的功能被越来越多的研究者探讨、研究，且研究成果证明环状RNA具有ceRNA机制、结合功能蛋白、m6A修饰、编码潜能等功能。目前，环状RNA的研究主要集中于医学中疾病的研究，尤其肿瘤癌症，如乳腺癌、大肠癌、胃癌、横纹肌肉肿瘤、神经胶质瘤等，但在动物肌肉发育的研究很少，且有些发现的、鉴定的circRNA功能机制仍不清楚，需进一步探讨、研究。在畜禽中发现新的circRNA，探索其功能机制，将会为分子生物学在动物肌肉的生长发育研究提供一些新的资源和线索，为畜牧业提供一个新的发展领域，促进畜牧业的发展。