膀胱癌肿瘤微环境中抑制性免疫浸润细胞的研究进展

黄 楠 综述，邓红彬 审校

(重庆医科大学附属第一医院肿瘤科，重庆 400016)

膀胱癌是泌尿系统最常见的肿瘤。在初诊时，约有75%的患者被诊断为非肌层浸润性膀胱癌(NMIBC)，约25%被诊断为肌层浸润性膀胱癌(MIBC)或转移性膀胱癌。免疫治疗在这两类分期的膀胱癌患者中发挥了重要作用。对于NMIBC肿瘤切除术后的中高危患者，术后行膀胱内卡介苗(BCG)灌注可降低肿瘤复发风险。而对于MIBC中顺铂不耐受或转移性膀胱癌的患者，免疫检查点抑制剂(ICIs)可提高肿瘤客观缓解率、延长患者生存期，但是仍有大部分患者不能从免疫治疗过程中获益[1-2]。

肿瘤微环境(TME)由肿瘤细胞、免疫细胞、间质细胞、细胞外基质、细胞分泌的因子组成，在肿瘤的发生、发展、转移、免疫抑制过程中发挥重要作用，其中TME内有一组具有免疫抑制表型的免疫浸润细胞，可通过内在或外在两种途径共同调控肿瘤免疫抑制。免疫抑制的内在控制是通过表达抑制性受体介导的，而外在控制是通过细胞间的接触和(或)分泌抑制因子介导的[3]。为提高膀胱癌患者对免疫治疗的反应率及拓宽免疫治疗策略提供参考，本文针对膀胱癌TME中的抑制性免疫浸润细胞，先概述其在多种肿瘤中的免疫调节功能及机制，再分别对其在膀胱癌微环境中促癌机制、潜在的治疗靶点、对预后的预测价值进行综述。

1 抑制性免疫浸润细胞的生物学功能及免疫调节机制

最近针对TME的研究发现，几种免疫浸润细胞展现出重要的免疫抑制功能，其包括髓样抑制细胞(MDSCs)、肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)、调节性T细胞(Tregs)和肿瘤相关中性粒细胞(TANs)。了解这些细胞的生物学功能及其发挥免疫抑制的作用机制或促癌机制，能够为逆转膀胱癌的免疫抑制微环境提供新的思路。

1.1MDSCs MDSCs是一群异质性的不成熟的髓系细胞，主要由两个亚群组成：单核性髓样抑制细胞(M-MDSCs)和粒性髓样抑制细胞(G-MDSCs)。在慢性炎症及肿瘤等病理状态下，MDSCs相关基因表达水平改变，使得微环境中活性氧(ROS)和一氧化氮(NO)水平增加，精氨酸酶(Arg1)、前列腺素E2(PGE2)和一些抗炎细胞因子表达上调，导致免疫抑制，并支持肿瘤的进展和转移[4]。MDSCs大致通过以下4种机制实现其促癌作用：(1)保护肿瘤细胞免受免疫杀伤；(2)TME的重塑；(3)转移前微环境的建立；(4)与肿瘤细胞相互作用促进上皮-间充质转化(EMT)[5]。

1.2TAMs 巨噬细胞几乎存在于人体所有组织中。根据环境中不同的刺激信号，巨噬细胞可以弹性分化为不同的表型，如M1和M2样巨噬细胞。在病原体感染或炎症早期，M1样或经典途径激活[γ干扰素(IFN-γ)]的巨噬细胞能够产生促炎细胞因子[白细胞介素-6(IL-6)、IL-12、肿瘤坏死因子α(TNF-α)等]，表现出杀伤和抗病原体效应。而慢性炎症时，M2样或替代途径激活(IL-4)的巨噬细胞通过产生抗炎细胞因子(IL-10、CCL-22等)、组织修复因子[转化生长因子β(TGF-β)、骨形态发生蛋白-2(BMP-2)等]、促血管化因子[血管生长因子A(VEGF-A)]，抑制免疫反应，并促进组织修复[6]。TAMs中部分表现为M1样巨噬细胞表型，尤其在肿瘤发生早期，呈现出抗肿瘤效应，而肿瘤通过对TAMs进行重编程，使得TAMs中绝大多数表现为M2样巨噬细胞表型，在促进肿瘤的发生、进展和转移过程中发挥重要的作用[7-8]。

1.3Tregs Tregs首次在小鼠中被描述为抑制性CD4+T细胞，对维持免疫稳态和自我耐受至关重要[9]。Tregs是有着Foxp3和(或)CD25表达的CD4+T细胞，Foxp3能够抑制炎症因子的转录，CD25为IL-2受体的α链。Tregs主要通过以下5种机制实现其免疫抑制功能：(1)释放抑制性细胞因子，如TGF-β、IL-10；(2)通过免疫检查点分子的细胞-细胞接触：如CTLA-4、LAG3；(3)通过穿孔素或颗粒酶诱导细胞溶解；(4)IL-2的消耗导致T细胞的凋亡；(5)通过胞外酶CD39将ATP水解为ADP和AMP，阻断效应T细胞的ATP供应，并占据T细胞表面A2A腺苷受体而抑制效应T细胞功能[3,10]。

1.4TANs 中性粒细胞是感染初期最重要的免疫防御细胞。但在肿瘤组织中，环境中的信号因子可调控中性粒细胞的分化及表型，使TANs具有不同的功能。当TME中含有IFN-β或TGF-β通路被抑制时，TANs表现免疫杀伤及抑癌作用的N1表型。当环境中富含TGF-β时，TANs表现出免疫抑制及促癌作用的N2表型，其细胞内的基因表达模式也发生变化，如CCL17、Arg1、MMP9上调[11]。N2中性粒细胞主要通过以下5种途径实现促癌作用：(1)通过产生ROS、NO，导致体细胞DNA失稳，促进肿瘤发生；(2)通过产生前列腺素E2(PEG2)等促进肿瘤细胞生长；(3)通过产生蛋白酶水解组织结构及抗肿瘤因子利于肿瘤细胞转移；(4)通过释放Bv8、基质金属蛋白酶(MMP-9)等促进肿瘤血管生成；(5)通过上调Arg1、PD-1抑制抗肿瘤免疫[11]。

2 膀胱癌TME中的免疫抑制细胞与肿瘤进展

肿瘤进展的标志之一是免疫抑制TME的形成[12]。在此环境下，肿瘤细胞逃逸免疫系统的杀伤是肿瘤进展的前提条件。同时，肿瘤细胞还需要和TME中的其他细胞相互作用，提供必备的信号分子和通路。若能够以免疫抑制细胞为中心，通过抑制这些信号通路，可能为抑制膀胱癌的进展提供新的策略。

2.1MDSCs可促进膀胱癌进展 最新的证据表明，膀胱癌微环境中的肿瘤细胞或其他细胞能够诱导MDSCs的募集，发挥免疫抑制作用，从而促进肿瘤进展。对97例膀胱癌患者的肿瘤组织分析发现，趋化因子CXCL2、MIF及MDSCs表面受体CXCR2的表达上调与更晚的临床分期有关[13]。膀胱癌细胞通过CXCL2/MIF-CXCR2信号通路诱导MDSCs的募集，随后MDSCs通过上调抑制性介质的表达，如Arg1、iNOS、ROS、PD-L1和P-STAT3，促进免疫抑制环境的形成及肿瘤进展[13]。CHEVALIER等[14]发现固有淋巴细胞2组(ILC2)能够通过分泌IL-13诱导MDSCs的募集，并上调了Arg1、iNOS和C/EBPβ的表达，显著抑制T细胞增殖，导致肿瘤进展。MDSCs促进膀胱癌进展的作用是较明确的，但目前研究是以回顾性分析为主，或研究对象主要集中于外周血循环MDSCs,故仍需要有更多的前瞻性研究来验证。

2.2TAMs能够促进膀胱癌进展 目前较多的研究表明，TAMs除介导免疫抑制实现肿瘤免疫逃逸外，还参与肿瘤进展的各个阶段。研究者对155例NMIBC患者的肿瘤组织分析发现，肿瘤细胞表面高表达的CXCL1能够促进TAMs和癌症相关成纤维细胞(CAFs)的浸润，并与肿瘤转移相关。TAMs及CAFs能通过产生CXCL1促进膀胱癌的侵袭性，促进癌细胞与两者之间的黏附。TAMs、CAFs及膀胱癌细胞三者共同建立的荷瘤小鼠中，CXCL1的过表达能够促进肿瘤的生长[15]。MARTNEZ等[16]发现，膀胱癌细胞表达的BMP-4参与了巨噬细胞向M2样表型的分化，而M2样巨噬细胞通过产生IL-6、TGF-β、VEGFA等因子促进肿瘤的进展。TAKEUCHI等[17]在21例膀胱癌患者的肿瘤组织中发现大量TAMs和M2样巨噬细胞分布，并且TAMs计数与微血管计数呈正相关，故推测出TAMs能促进肿瘤血管生成。CHEN等[18]发现长链非编码RNA——LNMAT1在淋巴结阳性的患者肿瘤中表达上调，并与淋巴结转移相关。LNMAT1能够表观激活趋化因子CCL2的表达和上调，促进TAMs的募集，TAMs通过分泌VEGFC促进膀胱癌淋巴管的生成及淋巴结转移。WU等[19]发现TAMs可通过产生CXCL8，刺激膀胱癌细胞分泌MMP-9、VEGF，从而促进肿瘤细胞的侵袭、迁移及内皮细胞管生成。这些研究表明，TAMs通过与肿瘤细胞及其他间质细胞的相互作用，促进膀胱癌细胞的侵袭、黏附和转移，促进肿瘤血管及淋巴管生成，从而促进膀胱癌的进展。但目前研究大多基于离体实验，需要进一步的动物实验来验证。

2.3Tregs能够促进膀胱癌进展 Tregs在正常情况下维持机体免疫稳态，但在TME中，通过诱导Tregs募集，发挥其免疫抑制功能，促进膀胱癌进展。CCR8是肿瘤组织中Tregs表面重要的趋化因子受体。CCR8能够通过上调转录因子Foxo1和c-MAF的表达，稳定Tregs表型及免疫抑制功能，塑造MIBC内的免疫抑制环境，促进膀胱癌进展[20]。在对犬膀胱癌组织的分析中，肿瘤细胞产生的趋化因子CCL17，能够与Tregs表面的受体CCR4结合，诱导Tregs向肿瘤组织浸润，实现免疫抑制功能，导致肿瘤进展[21]。尽管Tregs的免疫抑制作用已较为明确，但仍需要有更多的实验来支持。

2.4TANs可能与膀胱癌进展有关 目前针对TANs的研究主要集中于动物实验，或人体循环中性粒细胞。关于人体肿瘤组织中的TANs研究相对较少。细胞共培养实验发现，中性粒细胞通过上调雄激素受体(AR)信号，使得MMP-13在膀胱癌细胞的表达上调，从而促进膀胱癌细胞的侵袭[22]。由于TANs存在抑癌和促癌作用的两种表型，鉴于目前有限的研究，TANs与膀胱癌进展的关系需要进一步探索。

3 膀胱癌微环境中的免疫抑制细胞与抗肿瘤治疗

通过靶向膀胱癌微环境中免疫抑制细胞或信号通路，可作为一种潜在的抗肿瘤治疗方式。目前研究多针对MDSCs、TAMs、Tregs这3类免疫抑制细胞，而对TANs暂无明确的治疗靶点。推测可能是TANs两种表型鉴定的困难；其次是中性粒细胞作为机体重要的免疫防御细胞，通过靶向该细胞而实现抗肿瘤作用可能给机体造成严重的感染。

3.1抑制MDSCs能够提高化疗及免疫治疗疗效 单独靶向MDSCs的抗肿瘤效应是有限的，因此多数研究致力于靶向MDSCs联合传统治疗方式，产生协同增效作用。对荷瘤小鼠联合注射顺铂及MDSCs抑制剂(α-Gr1抗体)能够协同减少膀胱癌组织中G-MDSCs的数量，使得 CD8+T细胞含量增加，显著抑制肿瘤进展[23]。另一项研究发现，RS 504393(一种选择性的CCL2拮抗剂)能够抑制M-MDSCs募集,克服吉西他滨耐药，使得荷瘤小鼠的生存延长[24]。当对铂类耐药鼠注射MDSCs抑制剂时，MDSCs数量明显减少，而CD8+T细胞的浸润增加，产生抗肿瘤效应。当MDSCs抑制剂与α-PD-L1联合作用于耐药鼠时，观察到了显著的抗肿瘤效应，推测可能是由于MDSCs抑制剂通过增强CD8+T细胞的功能从而提高了α-PD-L1的抗肿瘤疗效[25]。靶向MSDCs联合其他治疗方式的临床研究已在其他肿瘤中开展(NCT03302247、NCT02991196等)，但针对膀胱癌的临床研究尚少见报道。

3.2TAMs可作为潜在治疗靶点 将膀胱癌细胞及巨噬细胞共培养发现，转录因子核因子κB (NF-κB )抑制剂BAY11-7082，能够通过miR-30a/NF-κB/Snail信号通路，抑制巨噬细胞向M2样表型分化，从而抑制癌细胞的上皮-间充质转化(EMT)，降低膀胱癌的侵袭及转移[26]。有研究者分析了一种TAMs亚型——DC-SIGN+TAMs，其在MIBC患者肿瘤组织中大量表达。与M2表型相似，DC-SIGN+TAMs能够分泌抗炎细胞因子，表现出免疫抑制及促癌作用。当用中和抗体废除DC-SIGN+TAMs的功能时，其产生抗炎细胞因子的功能被削弱，并且还能增强PD-1抑制剂介导的CD8+T细胞对膀胱癌细胞的免疫杀伤效应[27]。由于目前针对TAMs的研究主要集中于离体实验，故其作为治疗靶点需要更多的活体实验来证明。

3.3Tregs可作为潜在的治疗靶点 如前所述，CCR8能够稳定Tregs表型而实现免疫抑制功能，阻断CCR8可使Tregs失稳并转变为脆性表型，导致抗肿瘤免疫重新被激活，并进一步提高PD-1抑制剂的疗效[20]。在另一项研究中，CCL17-CCR4的结合能够诱导Tregs的浸润，当用人源化抗体阻断CCR4后，异种移植小鼠模型中Tregs的浸润和肿瘤的生长均受到抑制。患有自发性膀胱癌的犬对CCR4阻断剂同样可产生疗效应答，使其生存率提高[21]。值得注意的是，因为Tregs在维持机体免疫稳态的关键作用，故研究对象应限定为肿瘤组织中的Tregs，如何特异地靶向TME的Tregs将是今后的努力方向。

4 膀胱癌微环境中的免疫抑制细胞与患者预后

目前的研究证据显示，膀胱癌微环境中的某些免疫抑制细胞具有预后价值，这些细胞包括TAMs、Tregs和TANs。多数的研究结论倾向于高浸润水平的TAMs及Tregs与患者预后不良相关，而TANs的预后作用具有异质性。膀胱癌微环境的MDSCs预后作用尚不明确。

4.1TAMs的浸润与膀胱癌患者的预后相关 较多的证据提示TAMs的浸润水平与膀胱癌患者的预后呈负相关，但有少数的研究得出相反的结论。BOSTRÖM等[28]对184例手术后膀胱癌患者进行中位时间达6年的随访，发现肿瘤组织内高水平的M2样巨噬细胞计数是术后患者的独立预后风险因子。而在92例全膀胱切除术后的患者中，肿瘤内高水平的TAMs与更短的肿瘤特异性生存(CSS)及总生存率(OS)相关。YANG等[29]对91例T1高级别膀胱癌患者分析发现，在60个月的中位随访时间内，肿瘤组织内高水平的M2样巨噬细胞患者肿瘤复发和进展的风险增高，有更短的无复发生存(RFS)、无进展生存(PFS)和CSS。TAMs的浸润水平可能与BCG灌注治疗后肿瘤复发风险相关。99例经BCG治疗后的NIMBC患者，BCG治疗失败的肿瘤组织中发现大量的TAMs，并且占主导的M2样巨噬细胞集中在肿瘤组织的间质区域，该类患者具有更短的RFS[30]。71例NMIBC患者术后的肿瘤组织中，高含量的TAMs与BCG灌注治疗后更短的RFS或PFS相关[31]。与大多数研究结论相反的是，有研究对103例MIBC患者肿瘤组织分析发现，在CD163肿瘤细胞的亚组内，M2样巨噬细胞高浸润的患者比低浸润患者出现淋巴结转移的风险更低、CSS更长。CD163是巨噬细胞的标志分子，在肿瘤细胞上表达的CD163可能是浸润的TAMs与其杂交所致，这种杂合肿瘤细胞的DNA修复能力增强，故该类肿瘤中TAMs高浸润的患者预后反而更好[32-33]。尽管TAMs的预后作用似乎比较明确，但研究仍以回顾性分析为主，因此TAMs的预后价值需要更多的前瞻性研究来验证。

4.2Tregs的浸润与膀胱癌患者的预后相关 大多数研究证实Tregs浸润程度与膀胱癌患者生存率呈负相关。在携带自发性膀胱癌的犬中，肿瘤浸润性Tregs与预后不良有关[21]。高水平的CCR8+Tregs与患者更差的OS及RFS有关[20]。在115例NMIBC患者肿瘤组织中，发现高水平Tregs浸润的患者有更短的RFS，并且是复发的独立预测因子[34]。此外，在肿瘤间质内高水平Tregs浸润也与BCG灌注治疗后患者更短的RFS相关[31]。Tregs对膀胱癌预后的影响可能是通过与肿瘤细胞之间的相互作用实现。膀胱癌细胞表面S1P1的表达水平和Tregs浸润计数均与预后呈负相关。进一步研究发现，S1P1蛋白的上调能够促进膀胱癌细胞分泌TGF-β和IL-10，从而促进Tregs的生成及迁移[35]。但与大多数关于Tregs的预后作用研究结果相反的是，肿瘤侵袭前缘的低水平Tregs浸润，与患者更差的预后相关。深入研究提示，Tregs可能通过抑制膀胱癌细胞及TAMs表达侵袭因子MMP-2，从而降低肿瘤细胞的侵袭性，导致了Tregs在膀胱癌中的积极预后作用[36]。与TAMs研究现状相似，Tregs的预后价值需要更多的前瞻性研究来验证。

4.3TANs在膀胱癌中的预后价值具有异质性 在102例膀胱癌患者肿瘤组织中，TANs计数高的患者更易出现肿瘤复发，并且OS更短[37]。另一项研究纳入3个中心共计666例MIBC患者，发现TANs浸润水平越高的患者OS越短。对其中405例来自公共数据库的转录组表达谱进行基因集富集分析提示淋巴细胞和T细胞激活的两条通路均富集在TANs低浸润组，TANs的浸润与CD8+T细胞的浸润呈负相关，并且TANs低浸润组更能从辅助化疗中获益，这提示高浸润的TANs可能通过免疫抑制及化疗抵抗影响了膀胱癌患者的预后[38]。尽管部分研究发现高水平的TANs与不良预后相关，但仍有研究发现TANs计数与预后呈正相关。根据膀胱癌表面特征表达分子将MIBC分为腔内型(Lunimal)和基底型(Basal),发现基底型膀胱癌组织中有更多的CD66+TANs浸润，并且高浸润的TANs与患者预后呈正相关。进一步研究发现基底型肿瘤组织中表达高水平的促炎细胞因子(CXCL1、CXCL2、CXCL8)，促进TANs趋化作用[39]。推测此时的TANs因展现出N1表型而发挥抗肿瘤功能。在BCG治疗后可诱导膀胱癌组织内中性粒细胞外陷阱(NET)的形成。NET能够阻止膀胱癌细胞的存活、迁移及诱导细胞凋亡，并能通过攻击肿瘤细胞和增加免疫细胞浸润来抑制小鼠肿瘤的生长。故TANs与预后呈正相关的机制之一可能是NET的形成所致[40]。由于对TANs的研究较少，故对其预后价值需要进一步探究。

5 结 语

免疫治疗在早期及晚期膀胱癌患者中均占据重要地位。但无论是对NMIBC患者膀胱内注射BCG，还是对晚期膀胱癌患者应用ICIs治疗，都存在较高的失败率。肿瘤内免疫抑制微环境的形成是免疫治疗失败的重要机制之一，其中抑制性免疫浸润细胞发挥主要作用。本文通过对膀胱癌TME内4种抑制性免疫浸润性细胞的促癌机制及潜在的治疗靶点进行阐述，为提高免疫治疗应答提供了新的策略。目前靶向这些细胞联合免疫治疗的方式在膀胱癌的临床前实验中取得一定的疗效，但其疗效需要在临床试验中进一步验证。目前仍有几个重要问题亟待解决：一是确立这类抑制性免疫浸润细胞区别于其他表型的特异分子标志物；二是联合免疫治疗时，如ICIs，靶向这类细胞的治疗时机和最佳策略。因此，未来需要更多的基础及临床研究来探讨膀胱癌TME中抑制性免疫浸润细胞的生物学功能，期待有更多的患者能从免疫治疗中获益。