响应面法优化玉米蛋白粉饲料发酵工艺

江成英，刘晓兰，王 松

（1.梧州学院化学工程与资源再利用学院，广西梧州 543000；2.齐齐哈尔大学食品与生物工程学院，黑龙江齐齐哈尔 161006）

玉米蛋白粉是玉米加工后的具有高能量、高蛋白质的副产品，常作为一种饲料资源在畜禽饲料中使用（杨露等，2018）。但其气味特殊、口感不好、水溶性差、缺乏必需氨基酸等缺点，导致畜禽对玉米蛋白质的利用率相对较低，从而限制了其在饲料中的应用（赵谋明等，2019）。对玉米蛋白粉进行加工处理，提高其蛋白的水溶性是解决这一问题的关键。目前，常用处理方法有物理法、酶解法和微生物法。微生物发酵过程中产生的蛋白酶类能够将蛋白粉中难以被吸收利用的植物大分子蛋白质降解为分子质量较小的多肽、小肽或游离氨基酸，从而提高其蛋白的利用率（向丽蓉等，2019）。王念祥等（2009）利用好食脉孢霉发酵玉米蛋白粉，使蛋白粉的蛋白质溶出率达到25.31%。魏炳栋等（2017）研究表明，利用复合菌发酵玉米蛋白粉后，其粗蛋白质、多肽和总必需氨基酸含量均明显增加。王松等（2019）采用紫外诱变的方法,筛选出一株枯草芽孢突变菌株，可将玉米蛋白粉饲料中的可溶性蛋白转化率由原始菌株的37.39%提高到47.83%。

本试验以添加一定比例麸皮的玉米蛋白粉为原料，进行多菌种混合固态发酵饲料的制备，在单因素试验的基础上，采用4 因素3 水平的响应面分析法，优化发酵工艺，为玉米蛋白粉发酵饲料的生产奠定基础。

1 材料与方法

1.1 菌种 枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌均由齐齐哈尔大学生物工程实验室提供。

1.2 原料 玉米蛋白粉：中粮生化能源（龙江）有限公司提供；麸皮：市售。

1.3 试剂 酒石酸钾钠、碳酸钠、硫酸铜、氢氧化钠、氯化钠、酚酞、钨酸钠、盐酸、酵母粉、钼酸钠、磷酸、胰蛋白胨、硫酸锂、液溴、葡萄糖、琼脂等试剂均购自天津市凯通化学试剂有限公司。

1.4 主要仪器 SYQ-DSK-280B 型手提式压力灭菌器（上海申安医疗器械厂），TU-1810 型紫外可见分光光度计（日本岛津仪器厂），PHS-25 型数显pH 计（上海精密科学仪器有限公司），ZHJH-C2109C 型超净工作台（上海智城分析仪器有限公司），BS224S 型电子天平（北京赛多利斯仪器厂），PYX-DHS-40×50-BS-I 型隔水式电热恒温培养箱（上海跃进医疗器械厂）等。

1.5 试验方法

1.5.1 可溶性蛋白含量的测定 采用福林酚法测定可溶性蛋白含量（王永华，2010）。

1.5.2 单因素试验 将玉米蛋白粉与麸皮以一定比例混合，于121 ℃灭菌30 min，冷却至室温后接入混合菌种（枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌以1∶1∶1 的比例混合）进行固态发酵，通过测定发酵物料中的可溶性蛋白含量研究物料比、料水比、发酵温度、发酵时间和接种量对发酵饲料的影响。

1.5.3 响应面试验设计 在单因素试验的基础上，根据中心组合试验设计（CCD）原理，以可溶蛋白含量为响应值，使用Design-Expert8.0.5 软件，选取料水比（A）、接种量（B）、发酵温度（C）及发酵时间（D）为自变量，采用4 因素3 水平的响应面法对试验结果进行优化，以确定最佳的发酵工艺条件。试验因素与水平设计见表1。

表1 试验因素与水平

2 结果与讨论

2.1 单因素试验

2.1.1 发酵时间对可溶性蛋白含量的影响 将玉米蛋白粉与麸皮以7：3 混合，料水比为1：1.1，于121 ℃灭菌30 min，冷却至室温后接入5%的混合菌种于30 ℃进行固态发酵，48 h 后每隔12 h 检测发酵底物中的可溶性蛋白含量。结果见表2。

表2 发酵时间对可溶性蛋白含量的影响

2.1.2 发酵温度对可溶性蛋白含量的影响 将玉米蛋白粉与麸皮以7：3 混合，料水比为1：1.1，于121 ℃灭菌30 min，冷却至室温后接入5%的混合菌种分别于28、30、32、34 ℃进行固态发酵，84 h 后检测发酵底物中的可溶性蛋白含量。结果见表3。

表3 发酵温度对可溶性蛋白含量的影响

2.1.3 物料比对可溶性蛋白含量的影响 将玉米蛋白粉与麸皮分别以4：6、5：5、6：4、7：3、8：2 的比例混合，料水比为1：1.1，于121 ℃灭菌30 min，冷却至室温后接入5%的混合菌种于32 ℃进行固态发酵，84 h 后检测发酵底物中的可溶性蛋白含量。结果见表4。

表4 物料比（玉米蛋白粉：麸皮）对可溶性蛋白含量的影响

2.1.4 接种量对可溶性蛋白含量的影响 将玉米蛋白粉与麸皮以7：3 的比例混合，料水比为1：1.1，于121 ℃灭菌30 min，冷却至室温后分别接入1%、5%、8%、10%、15%的混合菌种于32 ℃进行固态发酵，84 h 后检测发酵底物中的可溶性蛋白含量。结果见表5。

表5 接种量对可溶性蛋白含量的影响

2.1.5 料水比对可溶性蛋白含量的影响 将玉米蛋白粉与麸皮以7：3 的比例混合，料水比分别为1：1、1：1.2、1：1.4、1：1.6，于121 ℃灭菌30 min，冷却至室温后接入5%的混合菌种于32 ℃进行固态发酵，84 h 后检测发酵底物中的可溶性蛋白含量。结果见表6。

由单因素试验结果可以看出，可溶性蛋白含量最高的单因素条件分别为：物料比7：3，料水比1：1.2，发酵时间84 h，发酵温度32 ℃，接种量15%。但15%接种量与5%接种量的可溶性蛋白提高不是很大，综合考虑经济因素，初步确定多菌种固态发酵玉米蛋白饲料的工艺条件为：物料比（玉米蛋白粉：麸皮）7：3，料水比1：1.2，发酵时间84 h，发酵温度32 ℃，接种量5%。

2.2 响应面法优化发酵工艺

2.2.1 模型的建立与显著性分析 在单因素试验基础上结合Box-Behnken 设计，选取原料物料比例为7∶3、混菌比例为1∶1∶1，以料水比例（A）、接种量（B）、发酵温度（C）和发酵时间（D）为影响因子，以可溶蛋白含量（Y）为响应值，设计4 因素3 水平响应面试验，以优化发酵玉米蛋白粉饲料的工艺参数，结果见表7。

表7 响应面设计及结果

采用Design-Expert.V8.0.6.1 软件对试验数据进行回归模型方差分析，结果见表8。

表8 回归模型方差分析

用Design-Expert.V8.0.5 软件对试验结果进行多元回归方程拟合，获得以感官评分为目标函数的二次回归拟合方程：

Y=12.56 +1.11A +0.25B +0.098C +0.30D +0.13AB-0.055AC-0.025AD+0.080BC-0.035CD-0.29A2-0.034B2+0.051C2-0.31D2。

由表8 可知，用响应面法建立的二次回归模型极显著（P ＜0.0001），失拟项不显著（P=0.0892＞0.05），说明所得模型拟合程度较好，该回归模型能够很好地对响应值进行预测。一次项B、一次项D、二次项A2和二次项D2为显著（P ＜0.05），一次项A 为极显著（P ＜0.01），交互项不显著（P ＞0.05）。各因素对发酵玉米蛋白粉饲料可溶蛋白含量的影响强弱次序为料水比例（A）＞发酵时间（D）＞接种量（B）＞发酵温度（C）。

2.2.2 响应面分析结果 各因素交互作用对可溶性蛋白影响的响应面图见图1。

图1 各因素交互作用对可溶性蛋白影响的响应面

2.2.3 发酵工艺的优化与验证结果 经Design-Expert8.0.5 软件优化处理后，得到发酵玉米蛋白粉饲料的最佳工艺条件为：原料物料比例7∶3、混菌比例1∶1∶1、料水比例1：1.3、接种量6%、发酵温度33 ℃、发酵时间87.08 h。

为了验证响应面优化的可行性，将响应面优化方案修约后的工艺条件进行3 组平行发酵试验，3 个试验组发酵饲料中可溶蛋白含量平均值可以达到13.77%，与理论预测值13.8894%的相对误差为0.85%，与试验结果相符。

3 结论

以多菌种组合进行固态发酵玉蛋白粉饲料的制备，通过单因素及响应面试验确定了最佳发酵工艺条件为：将玉米蛋白粉与麸皮以7：3 的比例混合，料水比为1：1.3，于121 ℃灭菌30 min，冷却至室温后接入6%的混合菌种（枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌以1∶1∶1 的比例混合），于33 ℃条件下固态发酵87.08 h。在此条件下，发酵饲料中可溶蛋白含量可达13.77%，可用于发酵玉米蛋白粉生产饲料。