基于网络药理学及实验验证探究甘松治疗帕金森病伴发焦虑的作用机制

李佳园，徐 文，万国慧，魏晓嘉，杨 雪，刘金凤，于佳禾，金重先，吕 研，王雨青，石晋丽

• 药理与临床 •

基于网络药理学及实验验证探究甘松治疗帕金森病伴发焦虑的作用机制

李佳园，徐 文，万国慧，魏晓嘉，杨 雪，刘金凤，于佳禾，金重先，吕 研，王雨青，石晋丽*

北京中医药大学中药学院，北京 102488

基于网络药理学方法预测甘松治疗帕金森病伴发焦虑（Parkinson’s disease with anxiety，PDA）的作用靶点和信号通路，并通过PDA模型大鼠进行药效学和关键靶点的验证。通过中药系统药理学数据库分析平台（TCMSP）和文献挖掘获得甘松主要化学成分，利用SwissTargetPrediction、GeneCards数据库获得甘松化学成分治疗PDA的潜在靶点，对其进行基因本体（gene ontology，GO）功能富集分析和京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析，利用Cytoscape 3.7.2构建“成分-靶点-通路”网络。大鼠采用颈背部sc鱼藤酮制备PD模型，并通过旷场实验筛选出PDA模型大鼠；设置对照组、模型组、甘松（620 mg/kg）组、左旋多巴（49 mg/kg）组，利用转棒实验、旷场实验和免疫组化法对甘松治疗PDA的药效学进行评价；并对关键蛋白和大鼠脑内神经递质含量进行测定。“成分-靶点-通路”网络中包含甘松抗PDA的12个有效成分如甘松新酮、诺卡酮、金合欢素、β-谷甾醇等，丝裂原活化蛋白激酶3（mitogen-activated protein kinases 3，MAPK3）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和信号传导与转录激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）等99个靶点，主要涉及神经活性配体-受体相互作用、雌激素、FoxO、TNF等信号通路。实验结果显示，甘松延长了PDA大鼠在转棒上的停留时间，增加了其在旷场的总活动距离及在中央区的活动时间和距离，提高了黑质区酪氨酸羟化酶阳性表达（＜0.05）；甘松显著降低大鼠纹状体MAPK3、TNF-α含量以及STAT3蛋白表达水平（＜0.05、0.01），提高了多巴胺、3,4-二羟基苯乙酸、高香草酸、5-羟色胺和5-羟吲哚乙酸水平（＜0.01、0.001）。甘松中的有效成分可能是通过MAPK3、TNF-α、STAT3等靶点调控多条信号通路来抑制神经炎症反应，提高神经递质水平以治疗PDA疾病。

甘松；网络药理学；帕金森病伴发焦虑；炎症因子；神经递质；丝裂原活化蛋白激酶3；肿瘤坏死因子-α；信号传导与转录激活因子3；甘松新酮；诺卡酮；金合欢素

帕金森病（Parkinson’s disease，PD）是我国第2大类神经退行性疾病[1]，主要临床表现为进行性运动迟缓、肌肉僵直、静止性震颤等运动障碍[2]。此外，一些非运动症状如焦虑、失眠、抑郁等也经常伴随PD发生，近期有学者研究发现，这些非运动症状大多出现在整个病程中，有些甚至出现在运动症状发病之前[3]。其中，焦虑被认为是PD最常见且损伤性较大的非运动症状之一[4]，PD伴发焦虑（Parkinson’s disease with anxiety，PDA）的患者在PD患者中占40%～50%[5]，焦虑不仅降低了PD患者的生活质量，还会加重PD患者的运动障碍和认知表现[6]，严重阻碍PD患者身体健康的恢复。目前PDA的发病机制尚未阐明，但随着研究的不断深入，认为PDA的发病机制涉及炎性细胞因子的异常表达[7]，下丘脑、黑质、纹状体的神经元功能退化及所含的多巴胺（dopamine，DA）、5-羟色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）等神经递质的含量下降等方面[8]。临床上常用的一些药物如左旋多巴、美多芭、劳拉西泮和丁螺环酮等对PDA患者具有一定的缓解作用，但长时间服用会引发异动症、睡眠障碍等不良反应，无法真正治疗该疾病[9]。因此未来的研究应进一步明确PDA的发病机制，找寻治疗PDA的有效靶点，提高药物的临床有效性和安全性。

甘松为败酱科植物甘松DC.的干燥根及根茎，在藏药中又被称为邦贝，具有理气止痛、开郁醒脾的功效[10-11]。李时珍在《本草纲目》中提出，甘松之甘源于“其味甘”，有补、和、缓之效，能理元气、去气郁、健脾胃[12]；在藏药中，甘松之松源于藏语bsung，意为“气味芳香”，有清热、解毒、消炎之效[13]。《中国药典》2020年版规定，甘松用量为3～6 g，且本品含甘松新酮（C15H22O3）不得少于0.10%。根据成人最高用量换算，得到大鼠口服剂量为620 mg/kg。本课题组前期研究发现，甘松80%乙醇的提取物（620 mg/kg，以生药量计）及甘松新酮均有良好的抗PD效果，其中甘松新酮治疗PD的机制可能与抑制c-Jun氨基末端激酶（c-Jun-terminal kinase，JNK）信号通路的激活，抑制线粒体凋亡途径，减少细胞的损伤有关[14]。现代药理学研究表明，甘松提取物具有潜在的抗焦虑活性并具有剂量相关性[15]；甘松提取物能够抑制脂多糖诱导的巨噬细胞凋亡，抑制炎性细胞因子，从而发挥抗炎作用[16]；此外，甘松还具有抗癫痫[17]、抗抑郁[18]等作用。综合甘松的传统功效和现代药理研究结果，推测甘松具有治疗PDA的潜力，但目前尚未有学者对甘松治疗PDA的药效和作用机制展开深入研究。因此本研究基于网络药理学方法，对甘松治疗PDA的关键靶点和信号通路进行预测，并利用PDA模型大鼠对其药效学和关键靶点进行验证，以期为甘松治疗PDA的临床应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 网络药理学预测甘松治疗PDA的作用机制

1.1.1 甘松化学成分的筛选 利用中药系统药理学数据库分析平台（TCMSP，https://tcmspw.com/ tcmspsearch.php），以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、化合物类药性（drug-likeness，DL）≥0.18为条件，对甘松的化学成分进行筛选；同时采用文献挖掘的方式收集甘松中的化学成分；将检索到的化学成分进行整合并去重，得到最终化学成分。

1.1.2 化学成分和PDA的相关靶点收集 利用PubChem数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）获得上述化合物的SMILES号，通过SwissTarget Prediction网站（http://www.swisstargetprediction. ch/）预测甘松化学成分的潜在靶点。利用GeneCards数据库（https://www.genecards.org/），以“Parkinson’s disease with anxiety”为检索词获取相关性得分≥10的PDA靶点。应用R语言软件对甘松化学成分和PDA的相关靶点取交集，得到两者的共同靶点，即甘松治疗PDA的潜在作用靶点。

1.1.3 蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络的构建与分析 在STRING平台（https://STRING-db.org/）输入潜在作用靶点，获得PPI网络。利用Cytoscape 3.7.2软件，对PPI网络进行可视化操作，根据Network Analyzer插件中的度值和介数评估每个靶点的重要性，得到关键靶点。

1.1.4 靶点功能富集分析与网络构建 通过DAVID数据库（https://david.ncifcrf.gov/）对甘松治疗PDA的潜在靶点进行基因本体（gene ontology，GO）富集分析和京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析，利用SangerBox平台（http://sangerbox.com/）的高级气泡图对排名前20的通路进行可视化分析。利用Cytoscape 3.7.2软件构建“成分-靶点-通路”网络，根据Network Analyzer插件对该网络进行拓扑学分析，确定关键化学成分。

1.2 实验验证

1.2.1 动物 SPF级雄性SD大鼠，8周龄，体质量200～220 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物合格证号SCXK（京）2016-0006。大鼠饲养于北京中医药大学SPF级动物实验中心，环境温度（20～22）℃，湿度（40～60）%，12 h光暗周期，自由进食饮水。动物实验方案符合国家实验动物福利伦理的相关要求，并获得北京中医药大学动物伦理委员会批准（批准号2020091406-3054）。

1.2.2 甘松药材及其提取物制备 甘松购自四川阿坝若尔盖县，经北京中医药大学石晋丽教授鉴定为败酱科植物甘松DC.的干燥根及根茎。将药材粉碎成粗粉，称取300 g，依次用10、8、8倍量80%乙醇超声提取3次，温度控制在35 ℃以下，时间分别为60、45、45 min，静置，滤过，合并滤液，冷冻干燥后于干燥器中保存。依据《中国药典》2020年版和文献方法[14]，测得甘松80%乙醇提取物中甘松新酮的质量分数为5.2%，甘松的出膏率为10.7%，即甘松生药中含甘松新酮0.56%，符合药典标准，见图1。

1.2.3 试剂与仪器 甘松新酮对照品（批号 P19A10L86397，质量分数≥98%）购自上海源叶生物科技有限公司；DA ELISA试剂盒、3,4-二羟基苯乙酸（3,4-dihydroxyphenylacetic acid，DOPAC）ELISA试剂盒、高香草酸（homovanillicacid，HVA）ELISA试剂盒、5-HT ELISA试剂盒、5-羟吲哚乙酸（5-hydroxyindolacetic acid，5-HIAA）ELISA试剂盒、丝裂原活化蛋白激酶3（mitogen-activated protein kinases 3，MAPK3）ELISA试剂盒、肿瘤坏死因子- α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA试剂盒（批号202103D）购自江苏酶免生物科技有限公司；酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase，TH）抗体（批号GB11181）、信号传导与转录激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）抗体（批号GB12176）、β-actin抗体（批号GB12001）、HRP标记的山羊抗小鼠二抗（批号GB23301）购自武汉赛维尔生物科技有限公司；鱼藤酮（批号R105076）购自上海阿拉丁生化科技有限公司；葵花籽油（批号W24A11L122237）购自上海源叶生物科技有限公司；左旋多巴购自北京曙光药业有限责任公司；乌拉坦（批号C10821103）购自上海麦克林生化科技有限公司。

图1 甘松80%乙醇提取物(a) 及对照品(b) 中甘松新酮的HPLC图

SB-5200DTD型超声波清洗机、JY96-IIN型超声波细胞粉碎机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；RE-52AA型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；RT-6100型多功能酶标仪（深圳雷杜生命科学股份有限公司）；电热恒温培养箱（武汉一恒苏净科学仪器有限公司）。

1.2.4 PDA大鼠模型建立及分组、给药 51只SD大鼠在SPF级条件下适应性饲养1周后，采用颈背部交替sc鱼藤酮法建立PD模型。取40只大鼠sc鱼藤酮葵花油溶剂（1.5 mL/kg）制备PD模型，取11只大鼠sc不含鱼藤酮的葵花油溶剂作为对照组，1次/d，连续14 d。当大鼠出现毛色发黄、精神萎靡不振、弓背和四肢力量减弱等症状时，表明造模成功[19]，共得到35只PD大鼠，造模成功率为87.5%。将造模成功的PD大鼠采用旷场实验筛选得到PDA大鼠33只。将筛选的PDA大鼠随机分为甘松（620 mg/kg）组、左旋多巴（49 mg/kg）组和模型组，每组11只，对照组11只。各给药组ig相应药物（0.2 mL/kg），1次/d，连续14 d。

1.2.5 转棒实验 末次给药次日进行转棒实验，检测大鼠的运动状态和平衡能力。在测试之前，先对大鼠进行为期3 d的训练实验，训练时将大鼠尾朝外侧放置在旋转棒上，适应环境20 s后，将转棒的转速由4 r/min匀速增加至20 r/min，加速度为6 r/min，最长训练时间为3 min。若大鼠中途掉落，将其再次放置转棒上，确保训练时间为3 min。正式测试时，转速和加速度与训练时一致，记录大鼠第1次从转棒上的掉落时间，每只大鼠检测3次，每次间隔2 h，取3次测试时间的平均值[20]。

1.2.6 旷场实验 转棒实验结束次日进行旷场实验，旷场实验为考察动物焦虑样行为的经典实验。将旷场（长100 cm、宽100 cm、高50 cm）放置在灯光较暗、环境安静的场所。旷场底面为黑色，被均分为25个方格，中间的9个方格为旷场的中央区，其余为边缘区。实验时先将大鼠放置在空旷的环境中适应5 min，然后将其放置在旷场的中央区，并记录大鼠在旷场5 min内的活动情况。每测试完1只大鼠，对旷场进行酒精消毒，待酒精挥发后进行下一只大鼠的测试。检测指标为大鼠在旷场中的活动总距离（cm），以及在中央区的活动距离（cm）和停留时间（s）。

1.2.7 TH免疫组化染色 旷场实验结束后，大鼠禁食不禁水12 h，ip 20%乌拉坦麻醉。剪开大鼠的胸腔，将灌注针插入心脏左心室，剪开右心耳进行心脏灌注操作。在冰上迅速剥离出完整的大脑，浸泡于10倍体积的多聚甲醛溶液中静置24 h。然后进行石蜡包埋，冠状面切片，梯度酒精脱水，染色，拍照，并将图片导入至Image J软件中，对阳性细胞的吸光度（）及区域总面积的比值进行分析，得到TH的平均值，以确定其表达情况。

1.2.8 纹状体MAPK3、TNF-α含量的测定 大鼠麻醉后，在冰上迅速取出纹状体，称定质量，采用超声波粉碎机进行匀浆，离心机离心，将采集到的上清液按照ELISA试剂盒说明书进行测定。

1.2.9 纹状体STAT3蛋白表达的检测 取各组大鼠纹状体，使用RIPA裂解液提取总蛋白，BCA法定量，蛋白样品经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至PVDF膜，于5%脱脂牛奶中室温封闭30 min，加入STAT3抗体（1∶1000）和β-actin抗体，4 ℃孵育过夜；加入HRP标记的山羊抗小鼠二抗（1∶5000），室温孵育30 min，然后利用化学发光成像系统，对ECL发光检测成像，拍照，AlphaEase FC软件计算条带灰度值。

1.2.10 纹状体神经递质水平的检测 取各组大鼠纹状体，采用超声波粉碎机进行匀浆，离心机离心，将采集到的上清液按照ELISA试剂盒说明书测定DA、DOPAC、HVA、5-HT和5-HIAA含量。

2 结果

2.1 甘松治疗PDA的网络分析结果

2.1.1 甘松化学成分及治疗PDA的潜在靶点 通过检索TCMSP数据库（OB≥30%、DL≥0.18）得到4个化合物，即表1中1～4。通过文献挖掘[21]，同时利用TCMSP考察这些化合物的OB值和DL值（OB≥30%、DL≥0.10），共得8个化合物，即表中的5～12。利用SwissTargetPrediction平台预测出甘松潜在靶点297个。通过GeneCards数据库得到与PDA相关的1114个作用靶点。R语言软件对甘松化学成分和PDA的相关靶点进行分析，共获得99个甘松治疗PDA的潜在作用靶点。

表1 甘松的主要活性成分

Table 1 Main active ingredients of

序号化合物ID化合物名称OB/%DL 1MOL010543刺槐苷39.840.71 2MOL001689金合欢素34.970.24 3MOL000358β-谷甾醇36.910.75 4MOL007088隐丹参酮52.340.40 5MOL010540甘松新酮66.340.17 6MOL004067诺卡酮33.040.10 7MOL000695广藿香醇101.960.14 8MOL000935α-古芸烯53.830.10 9MOL001566白菖烯52.160.11 10MOL001298去氢木香内酯58.570.14 11MOL012168马兜铃烯56.060.11 12MOL010534青木香酮20.690.15