安格斯牛UCP2和UCP3基因组织表达规律研究

张 娟，冯小芳，母 童，虎红红，马正旭，黄增文，王 影，顾亚玲，蔡正云

安格斯牛和基因组织表达规律研究

张 娟，冯小芳，母 童，虎红红，马正旭，黄增文，王 影，顾亚玲，蔡正云*

(宁夏大学农学院，银川 750021)

为了研究基因和基因在安格斯牛不同组织中的表达规律，运用实时荧光定量PCR技术检测和基因在安格斯牛心、肝、脾、肺、肾、大肠、小肠、背最长肌和皮下脂9种组织中的相对表达情况。结果表明：和在所检测的组织中均有表达，且在肺脏中的相对表达量最高，极显著高于其他组织（<0.01），其次为脾脏和肾脏，其表达量极显著高于除肺脏外的其他组织（<0.01），其余组织的表达量虽有差异，差异不显著（>0.05）；基因在皮下脂中的表达量极显著高于其他各组织（<0.01），其次为肾脏和肺脏，背最长肌的相对表达量极显著高于大肠、小肠、心脏、肝脏和脾脏组织（<0.01），其余各组织的相对表达量较低。通过对和基因在安格斯牛不同组织中的表达情况进行分析，揭示这两个基因在安格斯牛不同组织中的表达差异，为进一步拓展和基因在不同组织中的功能研究提供理论支持，在某种程度上为安格斯牛的育种提供一些基础资料。

基因；基因；安格斯牛；组织表达

解偶联蛋白（Uncoupling protein，）位于线粒体内膜，属于线粒体转运蛋白家族SLC25[1]。能够解偶联线粒体呼吸链中二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）的氧化磷酸化（oxidative，磷酸化）[2]。广泛存在于脊椎动物细胞中。的主要功能是调节“质子漏”反应降低电化学势（Δψm）,用于ATP合成[3]，家族有5个成员：是第一个在棕色脂肪组织中被识别和发现的。是一种质子转运体，在仓鼠、大鼠和豚鼠蝙蝠的线粒体中被几组科学家发现[4]。与相反，在身体的许多器官、组织和各种细胞类型中都有表达[5-6]，包括皮肤、肝脏、肾脏和肾小管细胞。在ATP合成和细胞代谢中具有调节作用，在肿瘤代谢中发挥重要作用。扩增已在许多人类癌症中被检测到，在胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、肺癌和皮肤癌等多种人类癌症中均有高表达[7]。也被认为是一种抗氧化剂，因为它抑制线粒体中活性氧（ROS）的生成[8]。因此，可以保护细胞免受氧化应激的损伤。此外，还参与控制其他几个生理和病理过程，包括神经退化、葡萄糖代谢、脂肪酸氧化能力对饥饿的适应、炎症反应和自噬[9]。有助于癌细胞耐受高负荷代谢状态[10]。在人类胆管癌组织中的表达水平上调[11]，基因在体内的表达受多种因素调控。对食物中的不饱和脂肪酸有反应，调节能量代谢[12]。可以被mirna调控，影响肿瘤的代谢和耐药[13]。的特性与其他线粒体载体具有高度同源性，特别是与的高度同源性，主要在骨骼肌和心脏中进行研究[14]。参与调节骨骼肌呼吸和骨骼肌纤维的pH值闪变频 率[15]。mRNA在骨骼肌的体内和体外表达均明显高于mRNA[16]。被认为是骨骼肌表达的主要，其功能是“质子泄漏”，降低三磷酸腺苷（ATP）的合成[17]。许多研究表明，在调节ROS的生成过程中起着重要的作用。它通过降低呼吸链的氧化还原压力，以防止细胞氧化损伤和维持生物体内能量代谢平衡[8]。与细胞脂肪酸代谢有关，在2型肌纤维（也称为糖酵解性肌纤维）中表达最高，禁食和高脂肪饮食可上调在中的表达在β-氧化缺陷患者中升高[18]，氧化能力的恢复降低了水平[19]。研究表明，线粒体基质中不能被氧化的脂肪酸被认为是由输出的，从而阻止了基质中脂肪酸的积累。因此，可能具有保护生理功能，对脂质诱导的线粒体损伤具有保护作用[20]。和主要位于大脑中，它们在能量稳态和神经保护方面发挥重要作 用[21]。

本试验以宁夏地区安格斯牛为研究对象，利用qPT-PCR技术检测和基因在安格斯牛不同组织中的差异表达情况，为肉牛和基因在不同组织和器官中的功能研究提供基础资料和理论支持，同时在一定程度上为宁夏安格斯牛的分子育种提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物及组织

本试验安格斯牛来自宁夏地区安格斯牛核心群选育示范场，在同一饲养条件下，选取3头（24±2）月龄健康无病安格斯牛的心、肝、脾、肺、肾、大肠、小肠、背最长肌和皮下脂9种组织，装入冻存管并迅速放入装满液氮的液氮罐中带回实验室， –80 ℃冰箱保存备用。

1.2 主要试验试剂

Trizol试剂，氯仿，异丙醇，RNase-free water;固相RAase 清除剂，购自北京天恩泽公司；HifairRⅡ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (gDNA digester plus)反转录试剂盒，购自上海翊圣生物科技有限公司；QuantiNovaTMSYBRRGreen PCR实时荧光定量试剂盒，选自Sample to Insight-QIAGEN生物公司；2Ípower Taq PCR MasterMix，选自无锡百泰克生物技术有限公司。

1.3 引物设计与合成

根据NCBI上提供的牛基因（登录号：NM_001033611.2）、基因（登录号：NM_174210.1）和内参基因（登录号：NM_001034034.2）的mRNA序列，利用Primer 5.0引物设计软件设计基因、基因和基因的引物，引物序列详见表1，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 安格斯牛UCP2、UCP3和GAPDH基因引物序列信息

1.4 基因组RNA的提取及检测

运用Trizol法提取安格斯牛各组织样品的总RNA，利用NANODROP核酸浓度检测仪检测总RNA浓度和OD值，1%的琼脂糖凝胶电泳检测样本RNA的完整性。

1.5 反转录和cDNA质量及qRT-PCR引物特异性检测

将完整性较好的RNA按照HifairRⅡ1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR(gDNA digester plus)反转录试剂盒操作说明将各组织的总RNA反转录为cDNA，并用核酸浓度检测仪检测cDNA的质量和浓度，以反转录的cDNA 为模板，通过PCR反应对目的基因（和）和内参基因特异片段进行检测，检测cDNA的完整性，进而判断引物的质量和特异性，采用20 μL的反应体系分别扩增基因、基因以及基因的目的片段，反应体系为：2 powerPCR MasterMix 10 μL，模板cDNA 1 μL，上下游引物各 0.5 μL（10 μmol·L-1），ddH2O 8 μL。反应程序为：94 ℃预变性 5 min，94 ℃变性 30 s，和退火温度均为60 ℃，退火温度为50 ℃，退火时间统一为30 s，72 ℃延伸30 s，30 个循环；72 ℃终延伸 5 min；4 ℃保存。PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测。

1.6 实时荧光定量PCR（qRT-PCR）反应

利用QuantiNovaTMSYBR○RGreenPCR实时荧光定量试剂盒对目的基因和内参基因在同一条件下进行扩增，摸索每对引物的扩增条件，找到适合目的基因和内参基因的扩增条件后再进行实时荧光定量PCR反应，反应总体系为20 μL，各组分添加量分别为：2ÍQuantiNova SYBR Green PCR Master Mix 10 μL，上下游引物各1 μL，模板cDNA 1 μL，RNase-free water 7 μL；反应条件：95 ℃预变性3 min，95 ℃变性10 s，基因的退火温度为59.5 ℃，基因的退火温度为51.4 ℃，退火时间为20 s；溶解曲线程序：温度由65 ℃增加至95 ℃，每5 s增加5 ℃。

1.7 数据处理

目的基因（和）在不同组织中的相对表达水平通过2-ΔΔCt法计算，计算分三步进行：首先计算ΔC=C—C，其中Tar代表目的基因，Norm代表内参基因，其次计算ΔΔC=ΔC— ΔC，Test代表试验组，Control代表对照组（待检组织中任一组织），最后计算和基因在各组织中的相对表达量为2-ΔΔCt，其中选取心脏为ΔC参照，将其表达量定为1，相对表达量用SAS9.4软件进行统计分析，以<0.05为差异显著，<0.01为差异极显著评判标准。

2 结果与分析

2.1 总RNA检测结果

各组织样品总RNA经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，可以看到清晰的28S和18S条带，结果如图1所示，说明样品总RNA的完整性达到后续试验的要求，用核算浓度仪检测其质量，结果显示：样品总RNA的260/280值在1.7～2.0之间，表明总RNA的质量满足接下来的实验要求。

图1 安格斯牛基因组RNA琼脂糖凝胶电泳图

Figure 1 Agarose gel electrophoresis of Angus cattle genomic RNA

2.2 cDNA质量及qRT-PCR引物特异性检测结果

内参基因、目的基因和扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果分别为图2中的（a）、（b）、（c），目的片段大小分别为106 bp、117 bp和136 bp，初步判断扩增产物为目的片段，与预期结果一致，表明qRT-PCR引物具有良好的特异性，同时也表明cDNA没有受到DNA等的污染。

2.3 qRT-PCR扩增产物特异性分析

通过对目的基因（和）和内参基因（）进行实时荧光定量PCR反应后得到各自的扩增曲线和溶解曲线，图3（a）、（c）、（e）分别为基因、基因和基因的扩增曲线，可以看到其扩增曲线基本都呈“S”型，且有明显的指数增长期，图3（b）、（d）、（f）分别为基因、基因和基因的溶解曲线，发现其溶解曲线都为单峰，窄而尖，表明其扩增特异性良好，没有引物二聚体或其他非特异性扩增产物。

2.4 安格斯牛UCP2基因和UCP3基因组织表达差异

通过实时荧光定量PCR检测和基因mRNA在安格斯牛心、肝、脾、肺、肾、大肠、小肠、背最长肌和皮下脂9种组织的表达情况，本研究以心脏组织和基因的△t均值为参照，计算和基因mRNA在安格斯牛不同组织中的相对表达量，结果见图4和图5，分别显示了和基因mRNA在其各组织中的表达丰度，结果显示：和基因mRNA在安格斯牛的9种组织中均有表达，其中基因mRNA在肺脏中的表达量最高，极显著高于其他组织（<0.01），其次为脾脏和肾脏，其表达量极显著高于除肺脏外的其他组织（<0.01），其余组织的表达量由大到小依次为：小肠>大肠>肝脏>皮下脂>心脏>背最长肌，但基因mRNA在这6种组织中的相对表达量差异不显著（>0.05）。基因mRNA表达量最高的组织为皮下脂，极显著高于其他各组织（<0.01），其次为肾脏的相对表达量，极显著高于除皮下脂的其他组织（<0.01），肺脏的相对表达量极显著高于除皮下脂和肾脏的其他组织（<0.01），背最长肌的相对表达量极显著高于大肠、小肠、心脏、肝脏和脾脏组织（<0.01），其余组织中，小肠的相对表达量与大肠和脾脏中的表达量差异不显著（>0.05），心脏与肝脏组织中的表达量差异也不显著（>0.05）。

图2 GAPDH、UCP2和UCP3基因PCR产物特异性检测

Figure 2 PCR product specificity of,andgenes

(a) UCP2基因扩增曲线；(b) UCP2基因溶解曲线；(c) UCP3基因扩增曲线；(d) UCP3基因溶解曲线；(e) GAPDH基因扩增曲线；(f) GAPDH基因溶解曲线。

Figure 3 GAPDH, UCP2 and UCP3 gene amplification and dissolution curves

1.心脏；2.肝脏；3.脾脏；4.肺脏；5.肾脏；6.大肠；7.小肠；8.背最长肌；9.皮下脂。

Figure 4 Expression ofmRNA in different tissues of Angus cattle

1.心脏；2.肝脏；3.脾脏；4.肺脏；5.肾脏；6.大肠；7.小肠；8.背最长肌；9.皮下脂。

Figure 5 Expression ofmRNA in different tissues of Angus cattle

3 讨论与结论

解偶联蛋白（Uncoupling protein,）是表达于线粒体内膜的转运蛋白，能够解偶联线粒体中二磷酸腺苷（ADP）的氧化磷酸化呼吸链[22]。也被认为是能量稳态的关键调控因子。其中基因位于大鼠1号染色体、小鼠7号染色体和人类11号染色体[23]。广泛表达于几乎所有哺乳动物组织中，并在多个水平上调节能量稳态，包括基因表达、转录和翻译后调控[24]。是一种典型的线粒体载体，在小鼠体内具有312个氨基酸肽链，排列在6个跨膜域中，由3个长基质环和2个较短的膜间空间环连接。是成人心肌细胞的一种特异性标记物，它依赖于脂肪酸氧化。蛋白在肌肉、心脏、脾脏和胸腺蛋白水平的表达均有报道[25]，还发现了和基因多态性与表型之间的关系，主要用于肉牛生长性状和肉质性状的选择[26]，本研究通过对安格斯牛和基因mRNA在心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、大肠、小肠、背最长肌和皮下脂9种组织中的相对表达量进行检测，进一步拓展和基因在肉牛组织中的功能，结果发现：和基因在安格斯牛的9种组织中均有表达，且基因在肺脏中的表达量最高，有研究表明，的表达与缺氧标志物有关，低氧会影响肺组织各项指标水平[27]，另外，脂多糖的增加会导致对肺有不良影 响[28]。可见该基因对肺功能的行使有很大的影响。也是线粒体中产生的负调控因子，通过调节各种细胞类型的固有凋亡通路来提高细胞存活率。抑制改变了的产生，使得在介导细胞存活的机制中发挥重要作用[29]。一些研究报道了对巨噬细胞、脾细胞和心肌细胞也具有保护作用[30]，本研究中该基因在脾脏和肾脏中的表达量极显著高于除肺脏外的其他组织（<0.01），这与赵武恒等[31]在小尾寒羊内脏中的研究结果有一定得相似性，进一步证明基因在脾脏中的高表达与机体免疫、延缓细胞衰老和保护细胞存活的相关性。在肾脏中的高表达可能与基因对调控机体的代谢变化有关，有研究者认为基因包括肥胖、糖尿病和癌症在内的代谢疾病的潜在靶点[32]。除此之外基因在其他组织中的表达量均差异不显著（>0.05），但在小肠和大肠中的表达量相对较高，表明可能影响肉牛饲料效率。Tizioto等[33]在最近的一项全基因组RNA测序研究中发现，在剩余采食量较低（饲料效率较高）的牛群体中，mRNA表达水平较高。另有研究发现精饲料喂养的牛皮下脂肪中解偶联蛋白的表达明显高于粗饲料喂养的牛。维生素a缺乏饲料喂养的牛肠系膜脂肪中的表达高于对照 组[34]。这些都能够很好的解释基因能够影响肉牛对饲料的利用效率。基因在皮下脂中的表达量最高，极显著高于其他各组织（<0.01），由于在棕色脂肪组织(BAT)和白色脂肪组织中高度丰富[35]，基因在抗寒猪品种中的表达量显著增加[36]，且有研究认为可以运输脂肪酸、脂质过氧化物和丙酮酸，对甘油三酯积累也具有保护作用[37]。由此可以推测基因对脂质代谢和脂肪合成具有潜在的影响。基因在肾脏和肺脏中的表达量极显著高于除皮下脂外的其他组织（<0.01），可见同为线粒体转运蛋白家族的成员，和基因在安格斯牛肺脏和肾脏中的表达量都较高，表明其在某些功能上具有一定的协同作用。基因在背最长肌中的相对表达量极显著高于大肠、小肠、心脏、肝脏和脾脏组织(<0.01)，这与王宏博等[38]对基因在欧拉型藏羊羔羊肌肉中的表达情况较一致，表明对安格斯牛胴体的发育存在一定程度的影响，国鹏 等[39]也发现基因在安格斯牛群体中存在多态性且与生长性状显著相关，进一步表明基因在安格斯牛生长发育中的重要作用。

本研究通过检测和基因在安格斯牛心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、大肠、小肠、背最长肌和皮下脂9种组织中的相对表达情况，发现和在所检测的组织中有不同程度的表达水平，通过对和基因在不同组织中的表达情况进行分析，揭示这两个基因在不同组织中的表达差异和发挥某些重要生物学的功能具有重要作用，以及对安格斯牛生长发育的影响，为进一步拓展和基因在不同组织中的功能研究提供理论支持，在某种程度上为安格斯牛的育种提供一些基础资料。

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Study on the expression ofandgenes in Angus cattle

ZHANG Juan, FENG Xiaofang, MU Tong, HU Honghong, MA Zhengxu,HUANG Zengwen, WANG Ying, GU Yalin, CAI Zhengyun

(School of Agriculture, Ningxia University, Yinchuan 750021)

In order to study the expression pattern ofgene andgene in different tissues of Angus cattleIn this study, real-time fluorescence quantitative PCR was used to detect the relative expression ofandgenes in heart, liver, spleen, lung, kidney, large intestine, small intestine, longissimus dorsi and subcutaneous fat of Angus cattle. The results showed thatandwere expressed in all tested tissues, and the relative expression ofin lung was the highest, which was significantly higher than that in other tissues(<0.01), followed by spleen and kidney, and the expression in spleen and kidney was significantly higher than that in other tissues except lung. The expression ofgene in subcutaneous fat was significantly higher than that in other tissues, followed by kidney and lung, and the relative expression of longissimus dorsi was significantly higher than that in large intestine, small intestine, heart, liver and spleen. Through the analysis of the expression ofandgenes in different tissues of Angus cattle, the expression differences of these two genes in different tissues of Angus cattle were revealed, which provided theoretical support for further research on the function ofandgenes in different tissues, and some basic data for Angus cattle breeding to some extent.

gene ;gene ;Angus cattle ; tissue expression

S823.8

A

1672-352X (2021)05-0777-07

10.13610/j.cnki.1672-352x.20211108.002

2021-11-9 11:30:27

[URL] https://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1162.s.20211108.1118.004.html

2020-12-24

宁夏自然科学基金项目(2019AAC03011)资助。

张 娟，博士，副教授。E-mail：zhangjkathy@126.com

通信作者:蔡正云，副教授。E-mail：caizhy@nxu.edu.cn