川续断水煎液对小鼠非特异性免疫功能的影响

周炳鑫，张 雷,2，李颜桃，马 跃,3,4，曹立亭,3,4*

川续断水煎液对小鼠非特异性免疫功能的影响

周炳鑫1，张 雷1,2，李颜桃1，马 跃1,3,4，曹立亭1,3,4*

(1. 西南大学动物医学院，重庆 402460；2. 毕节市七星关区农牧局，毕节 551700；3. 西南大学中兽医药研究所，重庆 402460；4. 重庆市兽医科学工程研究中心，重庆 402460)

为探讨川续断水煎液对小鼠非特异性免疫功能的影响。40只昆明系健康小白鼠随机分为5组，每组8只，分别灌胃不同剂量终浓度为2 g·mL-1的川续断水煎液（按体质量分别为10、20、30和40 g·kg-1），连续灌胃7 d，空白对照组灌胃等体积的生理盐水。通过对给药前后平均日增重、胸腺脾脏组织病理变化、巨噬细胞吞噬活性和血清溶血素等指标的检测，评价其对动物机体非特异性免疫功能的调节作用。结果显示，与空白对照组相比，灌胃川续断水煎液后能不同程度地提高试验各组小鼠平均日增重，各剂量组日增重率分别为9.8％、29.2％、24.4％和24.3％；可显著提高小鼠脾脏和胸腺指数（<0.05），对小鼠免疫组织有明显促进作用，脾脏中央动脉周围淋巴鞘的淋巴细胞密集，胸腺皮质与髓质分界清晰且胸腺细胞增多；极显著增强小鼠廓清指数（<0.01），显著增强吞噬指数及血清溶血素水平（<0.05）。提示川续断水煎液可增强小鼠的非特异性免疫功能。

川续断水煎液；小鼠；脏器指数；廓清指数；吞噬指数；血清溶血素；非特异性免疫

川续断为川续断科（）多年生草本植物川续断（）的干燥根，因能“续折接骨”而得名。川续断味苦、辛，性微温，归肝、肾经，具有补肝肾、强筋骨、续折伤、止崩漏及安胎等功效，可用于治疗肝肾不足所致的腰膝痿软、风湿痹痛以及筋伤骨折、崩漏、胎漏和跌扑损伤等病证。现代研究表明，川续断含有三萜皂苷、生物碱、挥发油和多糖类等多种化学成分[1]，其中三萜皂苷具有抗骨质疏松、增加骨密度等药理作用[2]，总生物碱能抑制妊娠大鼠在体子宫平滑肌的收缩活动，并降低收缩幅度和张力[3]，挥发油对金黄色葡萄球菌具有抑制作用。除此之外，川续断还能对神经系统、骨组织以及免疫系统产生影响[4]。然而，对川续断在机体免疫功能方面的研究报道较少。因此，本试验拟将川续断水煎液灌胃小鼠，观察其对机体非特异性免疫功能的影响，为深入探究其免疫作用机制奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验药物及主要试剂

川续断饮片，购自重庆泰尔森制药有限公司。豚鼠冻干血清补体，购自北京博尔西科技有限公司；印度墨汁，购自南京都莱生物技术有限公司。

1.2 试验动物

昆明系小鼠，雌雄各半，体重（20 ± 2） g，委托西南大学荣昌校区实验动物平台统一订购。

1.3 试验方法

1.3.1 川续断水煎液的制备 采用水煎法，按照1∶5加入提取溶剂进行提取，每次提取1 h，合并两次提取液，最后浓缩至相当于生药量2 g·mL-1的药液，保存备用。

1.3.2 试验设计及处理 40只昆明系小鼠，雌雄各半，体重（20 ± 2） g，随机分为5组，即A、B、C、D4个试验组和对照组。试验组分别按体质量灌胃10 g·kg-1、20 g·kg-1、30 g·kg-1和40 g·kg-1终浓度为2 g·mL-1的川续断水煎液，对照组灌胃等量生理盐水，1 次·d-1，连续灌胃7 d。

1.3.3 小鼠平均日增重的测定 分别于给药前1 d、末次给药后1、7 d早晨空腹称量各试验组小鼠体重并记录，计算小鼠的平均日增重。

1.3.4 免疫器官指数的测定 末次给药后7 d脱颈椎处死各试验组小鼠，摘取胸腺、脾脏，用滤纸吸干血迹以及表面水分后称重，计算其脏器指数。

1.3.5 免疫器官组织切片的制备 无菌操作采取各试验组小鼠胸腺和脾脏组织块，按照常规方法制备组织切片，光学显微镜下观察脏器的组织结构变化情况。

1.3.6 小鼠巨噬细胞吞噬功能的测定[5]于末次给药后按0.01 mL·g-1体质量尾静脉注射4倍稀释的印度墨汁，分别于注射后2，10 min用肝素处理的毛细玻管采集眼眶静脉血0.04 mL，溶入4 mL 0.1% Na2CO3溶液中，摇匀，然后以0.1% Na2CO3溶液作为空白对照，650 nm处检测其吸光度值（1和2），计算碳粒廓清指数（）；准确摘取小鼠肝脏、脾脏并称重，计算吞噬指数α值。

1、2代表先后两次所测的吸光度，t为体质量，g为肝质量，p为脾质量，1和2分别代表代表2 min和10 min。

1.3.7 小鼠血清溶血素的测定 灌胃给药7 d后按0.01 mL·g-1体质量腹腔注射5%鸡红细胞（CRBC）悬液，连续免疫7 d，末次免疫24 h后，眼球取血，室温静置2 h，4 ℃ 2 000 r·min-1离心10 min，分离血清，保存备用。检测前，待检血清用生理盐水进行100倍稀释，取稀释后的血清2 mL与5% CRBC悬液1 mL、10%豚鼠血清补体1 mL混匀。另设空白对照管（生理盐水代替血清）作为调“0”和CRBC半数溶血管。37 ℃培养箱中反应30 min后转入至0 ℃终止反应。3 000 r·min-1离心10 min，取上清于紫外分光光度计540 nm处测光密度值，溶血素值以半数溶血值HC50表示。

取5% CRBC 0.25 mL加生理盐水至2 mL， 3 000 r·min-1离心10 min，取上清于540 nm处比色，得到CRBC半数溶血时的吸光度[6-7]。

2 结果与分析

2.1 川续断水煎液对小鼠平均日增重的影响

与空白对照组相比，灌胃川续断水煎液后均能不同程度地提高试验小鼠的平均日增重。除10 g·kg-1灌胃剂量组外，其余剂量组平均日增重均显著升高（<0.05），分别提高29.2%、24.4%和24.3%，但各剂量组之间统计学比较差异不显著（>0.05）。详见图1。

A. 10 g·kg-1剂量组；B. 20 g·kg-1剂量组；C. 30 g·kg-1剂量组；D. 40 g·kg-1剂量组。

Figure 1 Effect ofdecoction on average daily gain in mice

2.2 川续断水煎液对免疫器官指数的影响

由图2可知，与空白对照组相比，灌胃川续断水煎液后均显著或极显著提高试验小鼠胸腺指数和脾脏指数，分别提高23%、30%、27%、26%和24%、34%、27%、27%，其中以20 g·kg-1灌胃剂量效果最佳（<0.01）。但各剂量组之间比较差异不显著（＞0.05）。

图2 川续断水煎液灌胃后免疫器官指数的变化情况

Figure 2 Effect ofdecoction on the indexes of immune organs in mice

2.3 川续断水煎液对小鼠免疫器官组织结构影响

2.3.1 对脾脏组织结构的影响 由图3可知，与空白对照组相比，灌胃川续断水煎液后，小鼠脾脏组织生发中心和淋巴鞘的淋巴细胞密集程度明显增高，其中以20 g·kg-1灌胃剂量效果最明显。

白色箭头所示为生发中心，黑色箭头所示为淋巴鞘。

Figure 3 The microstructure of spleen tissue in mice（HE, 100×）

白色箭头是髓质，黑色箭头是皮质。

Figure 4 The microstructure of thymus tissue in mice（HE, 100×）

图5 川续断水煎液对小鼠碳粒廓清指数的影响

Figure 5 Effect ofdecoction on the carbon clearance index in mice

2.3.2 对胸腺组织的影响 由图4可知，空白对照组小鼠胸腺组织细胞较稀疏，灌胃川续断水煎液后小鼠胸腺的皮质与髓质分界清楚，皮质中胸腺细胞密集。

2.4 川续断水煎液对小鼠巨噬细胞吞噬功能影响

从图4和图5可知，灌胃川续断水煎液后碳粒廓清指数（K）均极显著性升高（<0.01），同时显著或极显著升高吞噬细胞的吞噬指数（<0.05或<0.01），但各剂量组之间统计学比较差异不显著。其中以20 g·kg-1灌胃剂量组效果最佳。

图6 川续断水煎液对吞噬指数的影响

Figure 6 Effect ofdecoction on the phagocytic index in mice

图7 川续断水煎液对小鼠血清溶血素的影响

Figure 7 Effects ofdecoction on serum hemolysin level in mice

2.5 川续断水煎液对血清溶血素的影响

与空白对照组相比，灌胃不同剂量川续断后血清溶血素含量明显升高，其中灌胃20 g·kg-1、30 g·kg-1、40 g·kg-1剂量组统计学比较差异显著（<0.05）。但各剂量组之间统计学比较差异不显著（图6）。

3 讨论

“药食同源”是中（兽）医养生保健的物质基础，中药不仅可用于临床病证的防治，还可以用于调理机体功能，如促进动物生长、增强机体免疫力、提高动物生产能力等。中药含有多种活性成分如多糖、皂苷、生物碱、黄酮、挥发油等，不同的有效药用成分对机体产生不同的药理作用[8-9]。三萜皂苷是川续断中的主要有效成分，具有抗菌、抗炎、保肝以及调节机体免疫力的作用。本研究以小鼠为试验动物探究灌胃川续断水煎剂对其生长性能的影响，结果显示，灌胃川续断水煎液后可明显提高试验小鼠的平均日增重，分别提高了9%、29%、24%和22%，其中20 g·kg-1剂量组效果最佳。这可能是川续断在煎煮过程中三萜皂苷与多糖形成糖萜 素[10]，从而提高了饲料利用率。

胸腺与脾脏分别是动物机体中枢免疫系统和外周免疫系统的重要器官，胸腺的生理性萎缩最先发生于皮质，皮质区淋巴细胞减少，皮质区域的大小表明胸腺细胞的增殖情况[11]。谭文波等[12]报道川续断含有的维生素E可以通过提高SOD和GSH-Px的活性，降低MAD的生成，延缓免疫器官的萎缩。本试验发现，灌胃川续断水煎液后可显著提高试验小鼠胸腺指数（<0.05），皮质部与髓质部分界线清晰，皮质中胸腺细胞大量密集，减缓了胸腺组织的生理性萎缩进程，这与郑素玲等[13]报道的结果相一致。脾脏淋巴鞘和生发中心的多少和大小可以表明脾脏淋巴细胞的增殖情况，灌胃不同剂量川续断水煎液后能极显著提高试验小鼠脾脏指数（<0.01），提高脾脏组织生发中心和淋巴鞘的淋巴细胞密集程度，促进脾脏淋巴细胞的增殖。这与中药增强动物机体免疫功能的相关研究报道结果相一致[14-16]。

巨噬细胞作为天然免疫调节细胞具有极强的吞噬能力，该功能的激活包括细胞增殖及功能活跃两个方面，常用廓清指数（K）和吞噬指数（α）相结合反映巨噬细胞的增殖状态及功能状态。大量研究证实中药及其提取物可显著增强吞噬细胞的吞噬功能，提高吞噬细胞的吞噬指数和吞噬活性[17-19]。本试验中，灌胃不同剂量的川续断水煎剂后均显著或极显著提高了试验小鼠吞噬细胞的碳粒廓清指数和吞噬指数，说明川续断水煎剂可提高机体巨噬细胞的吞噬功能，从而增强机体的非特异性免疫功能。

体液免疫是由B淋巴细胞介导的免疫应答反应。许多中草药及其活性成分均能促进机体的体液免疫功能，促进抗体的生成，从而提高机体的免疫力[20-22]。血清溶血素是机体B淋巴细胞在受到抗原刺激后分化为浆细胞，由浆细胞产生免疫球蛋白，其含量反映了抗原刺激后机体的特异性免疫反应水平。本研究结果显示，灌服川续断水煎液后试验小鼠血清溶血素含量呈现升高趋势，表明川续断水煎液可提高机体的体液免疫功能，这与相关中药研究报道结果一致[7]。

综上表明，川续断水煎液可有效增强小鼠非特异性免疫功能，尤以20 g·kg-1灌胃剂量效果最佳，为进一步研究川续断作为免疫增强剂或饲料添加剂提供了的理论依据。

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Effect ofdecoction on nonspecific immune function in mice

ZHOU Bingxin1, ZHANG Lei1,2, LI Yantao1, MA Yue1,3,4, CAO Liting1,3,4

(1. College of Veterinary Medicine, Southwest University, Chongqing 402460; 2. Qixing District Agriculture and Animal Husbandry Bureau in Bijie City, Bijie 551700; 3. Research Institute of Traditional Chinese Veterinary Medicine, Southwest University, Chongqing 402460; 4. Chongqing Engineering Research Center of Veterinary Medicine, Chongqing 402460)

In order to estimate the regulatory effects on immune function, this study was conducted to investigate the effect ofdecoction on nonspecific immune function in mice in order to estimate the regulatory effects on immune function. Forty healthy Kunming mice were randomly divided into 5 groups with 8 mice each. All the experimental mice were intragastrically administrated different doses ofdecoction respectively (10, 20, 30 and 40 g·kg-1body weight) with the final concentration of 2 g·mL-1for 7 d, and physiological saline was administrated for the control group. The average daily gain (ADG), pathological changes of thymus and spleen, phagocytic activity of macrophages and serum hemolysin were detected before and after administration to evaluate the nonspecific immune function of the experimental animals. The results indicated that the average daily gain was increased at different extent after oral administration ofdecoction compared with control group, and the ADG rates were 9.8%, 29.2%, 24.4% and 24.3% in each group, respectively. And it could significantly increase the spleen and thymus index of mice (<0.05), and significantly promote the immune tissue of mice. The lymphocytes in the lymphatic sheath around the central artery of the spleen were concentrated, the boundary between the thymus cortex and medulla was clear, and the thymic cells were increased. It can also significantly enhance the clearance index (<0.01), phagocytosis index and serum hemolysin level (<0.05). It suggested thatdecoction enhance the non-specific immune function of mice.

decoction; mice; immune organ index; clearance index; phagocytic index; serum hemolysin; non-specific immunity

S 853.7

A

1672-352X (2021)05-0796-05

10.13610/j.cnki.1672-352x.20211105.003

2021-11-11 16:29:14

[URL] https://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1162.S.20211110.1506.002.html

2021-01-27

西南大学博士基金（09BSR04）和西南大学荣昌校区青年基金共同资助。

周炳鑫，硕士研究生。E-mail：1059475677@qq.com

通信作者:曹立亭，博士，副教授。E-mail：caoliting@swu.edu.cn