姜黄在啮齿类实验动物标认中的应用

矫 建 张婷婷 鹿 麟 刘进朋

(大连市检验检测认证技术服务中心，大连 116021)

在进行医学生物学及其他学科的实验研究前，常常需要将实验动物按适当的要求进行分组和编号，那么就需要使用准确、迅速、可靠、简便且安全的标认方法。邓青松等[1]报道，实验动物的标认方法，有染色法、剪脚趾法、剪耳朵法、耳朵打孔法、烙印法、号牌法等。其中，染色法是实验室最常用及最易掌握的方法，苦味酸、硝酸银等常用于染色标认动物，但目前此方法所使用的染料具有毒性、污染环境、难购买等缺点。本研究通过考察姜黄(Curcumae longae rhizoma)的皮肤毒性反应，探讨其标认实验动物的可行性，既解决了上述染料存在的不足，又符合动物福利原则。

1 材料和方法

1.1 实验动物

成年健康皮肤无疾患的普通级白化豚鼠58只，雌雄各半，体质量为250～350 g，6只用于染色标认考察，12只用于皮肤光毒性实验(阳性对照组和样品组各6只)，40只用于皮肤变态反应实验(其中，阳性对照组、阴性对照组各10只，样品组20只)。成年健康皮肤无损伤的新西兰白兔， 4只，体质量为2.1～2.8 kg，用于多次皮肤刺激性实验。实验动物由大连医科大学提供，实验动物生产许可证号：SCXK(辽)2018-0003。实验动物使用许可证号：SYXK(辽)2016-0005。环境温度21～23 ℃；相对湿度45%～57%；动物饲料购自北京科澳协力饲料有限公司，动物饮水符合我国生活饮用水卫生标准，在整个受试期间动物自由摄食饮水，实验前在实验动物房适应3 d。本实验已通过大连药品检验检测院福利伦理审查，审查编号：2020002。

1.2 主要试剂与仪器

姜黄购自大连市药品检验所中药室；8-甲氧基补骨脂(8-MOP，C1523020，纯度98%)及肉桂醛(WXBB1669V，纯度93%)购自Sigma；HOPE-MED8130B皮肤光毒机购自天津开发区合普工贸有限公司。

1.3 方法

1.3.1试药及试剂配制

1.3.1.1姜黄提取物：将姜黄粉碎，过80目筛，称取粗粉1 g 加 10 mL 75%乙醇混匀后，静置过夜。取上清液进行实验。

1.3.1.21 mg/mL 8-MOP溶液：称取8-MOP适量，用无水乙醇溶解，混匀。

1.3.1.35%肉桂醛丙酮溶液：量取肉桂醛适量，用丙酮稀释，混匀。

1.3.2染色效果考察：按九分法标号原则先左后右和由前至后。如图1所示，根据孙敬方[2]方法，左前肢的斑点表示1号，腹部左侧表示2号，左后肢表示3号，头顶表示4号，腰背部表示5号，尾基部表示6号，右前肢表示7号，腹部右侧表示8号，右后肢表示9号。标认后于1、7、14、21 d观察及记录着色情况。

图1 九分法标号

1.3.3皮肤毒性考察

1.3.3.1多次皮肤刺激性实验：实验前24 h，将实验动物背部脊柱两侧毛剪掉，不损伤表皮，去毛范围左、右各约3 cm×3 cm。取姜黄提取液0.5 mL直接涂在实验动物皮肤上，然后用无菌敷贴和一层保鲜膜覆盖，再用无刺激性胶布加以固定，另一侧皮肤作为对照。每天涂抹一次，连续涂抹14 d。从第2天开始，每次涂抹前剪毛，用温水清除残留受试物，1 h后观察结果，并进行评分。按下列公式计算每天每只动物平均积分，判定皮肤刺激强度，每天每只动物平均积分=(∑红斑和水肿积分/受试动物数)/14。

1.3.3.2皮肤光毒实验：实验前24 h，将豚鼠脊柱两侧皮肤去毛，实验部位皮肤需完好，无损伤及异常。备4 块去毛区(图 2)，每块去毛面积约为 2 cm×2 cm。将豚鼠固定，在去毛区1和去毛区2涂敷0.2 mL姜黄提取液。涂敷30 min 后，进行光照。左侧用铝箔复盖，胶带固定，右侧用紫外线A波段(365 nm)进行照射，照射剂量为10 J/cm2。结束后分别于1、24、48和72 h观察皮肤反应，判定每只动物皮肤刺激反应积分。单纯涂受试物而未经照射的区域(即1区)未出现皮肤反应，而涂受试物后经照射的区域(即2区)出现皮肤刺激反应积分≥2的动物数为1只或1只以上时，判定受试物具有光毒性。以1 mg/mL的8-MOP溶液为阳性对照物，同法操作。

图2 皮肤光毒实验去毛区

1.3.3.3皮肤变态反应：实验前24 h，将豚鼠背部左侧去毛4～6 cm2。取姜黄提取液和5%肉桂醛约0.2 mL分别涂在豚鼠去毛区皮肤上，以无菌敷贴和一层保鲜膜覆盖，再以无刺激胶布封闭固定6 h。第7天和第14天以同样方法重复一次。末次诱导后14 d，将0.2 mL姜黄提取液涂于豚鼠背部右侧2 cm×2 cm去毛区(接触前24 h脱毛)，然后用同样方法固定6 h。激发接触后24 h 和48 h 观察皮肤反应。当受试物组动物出现皮肤反应积分≥2时，判为该动物出现皮肤变态反应阳性，并判定受试物的致敏强度。实验同时设阴性对照组，在诱导接触时仅涂以75%乙醇为阴性对照，在激发接触时涂以姜黄提取液。阳性对照组，以5%肉桂醛丙酮溶液为阳性对照，同受试物的实验方法操作，阳性对照组的皮肤变态反应阳性率应大于30%。

2 结果

2.1 染色效果

如图3所示，编号为1和2的两只豚鼠的姜黄染色，直到21 d依然清晰可见。姜黄提取物的染色性能优良，色彩明亮鲜艳，具有较好着色效果。

图3 姜黄提取物染色效果的变化

2.2 皮肤毒性实验结果

2.2.1多次皮肤刺激性实验结果:见表1所列。14 d，每只家兔的皮肤均未出现红斑水肿，皮肤积分均值为0，每天每只动物平均积分为0，说明姜黄提取物对皮肤无刺激性。

表1 姜黄提取物对家兔多次皮肤刺激性实验结果

2.2.2皮肤光毒实验结果：单纯涂敷阳性对照物而未经照射的区域未出现皮肤光毒反应，而涂敷阳性对照物经照射的区域在24 h时均出现皮肤重度红斑及轻微水肿，并随着时间延长慢慢消退，皮肤反应积分均≥2(表2)。涂敷姜黄提取物而未经照射的区域以及经照射的区域均未出现皮肤光毒反应，说明姜黄提取物无光毒性(表3)。

表2 阳性对照物对豚鼠皮肤光毒性实验结果

表3 姜黄提取物对豚鼠皮肤光毒性实验结果

2.2.3皮肤变态反应结果:阳性对照组的皮肤均出现红斑，其中5只为轻微红斑，4只红斑较重并伴有轻微水肿，1只为严重红斑伴有轻微水肿，皮肤反应评分≥2的动物数为5只，皮肤变态反应阳性率为50%，大于30%符合实验要求，阴性对照组的皮肤未出现红斑水肿，皮肤反应积分≥2的动物数为0只(表4)。样品组皮肤未出现红斑水肿，皮肤反应积分≥2的动物数为0只，说明姜黄提取物无致敏性。

表4 豚鼠皮肤变态反应实验结果

3 讨论

国内外传统实验动物的标认有许多方法，包括耳部标认、笼上标认、金属材料打箍的标认、剪趾标认、染色标认等。以上传统方法，适用于不同实验，各有其优缺点。耳部标认方法虽然快速、方便，但造成一定损伤、笼上标认方法适用范围有限，且易搞乱或遗失标牌、金属材料打箍的标认方法会妨碍实验动物的发育生长、剪趾标认只适宜于小、大鼠等。豚鼠的足趾短而宽,不适用上述方法[3]。而染色法适用范围广泛，具有快速、简单、方便、不会给实验动物造成损伤和痛苦等特点。赵寒昕等[4]报道，常用的染色剂有3%～5%苦味酸溶液、0.5%中性红或品红溶液、2%硝酸银溶液、煤焦油酒精溶液及甲紫溶液。由于染色剂、实验动物、环境等原因，易造成染色标认褪色及模糊不清，而且常用染色剂的毒性对实验动物和环境的影响，以及难以购买的等问题也是需要注意的。

天然植物染料是从植物中获得、很少经过化学加工，无毒、无害且无污染。天然植物染料有紫草、青黛、姜黄等。本研究曾用紫草、青黛的乙醇或水的提取物进行染色标认，但易褪色且模糊不清，染色效果不佳。姜黄在全国多地种植易于购买，属于活血化瘀中草药，可提取黄色食用染料，也作为保健食品原料，具有良好的经济价值。姜黄染料的有效成分是姜黄中的姜黄素，又称姜黄色素[5]，具有安全性高、热稳定性好、着色力强、色泽鲜亮等特点，有很大的开发价值。李然等[6]对姜黄素的安全性毒理学进行了评价，研究表明姜黄素属实际无毒物质，未见潜在的致突变、致微核及致畸作用，无明显亚慢性毒性损害作用。本研究对姜黄提取物的皮肤毒性进行了考察，结果表明用姜黄提取物对实验动物进行染色标认安全可靠，染色时间长，且不易褪色。

本研究考察了姜黄乙醇提取物的皮肤刺激性、皮肤光毒性及其着色度，结果表明其可用于豚鼠和大、小鼠等动物实验中的标认，具有安全、低毒等优点。下一步，希望通过其他物理和化学的方法对其进行改性，以提高其染色牢度[7-10]。