基于DNA酶催化反应建立适配体比色法检测鸡蛋中氯霉素

程 慧 刘 顺 黎 波 黄玉兰 - 周 涛

(1. 黄梅县公共检验检测中心，湖北 黄冈 435501；2. 荆州职业技术学院，湖北 荆州 434000；3. 石首市公共检验检测中心，湖北 石首 434400)

氯霉素是一种高效的抑菌性广谱抗生素，在蛋鸡养殖过程中常作为治疗抗生素，其在蛋鸡体内的消除半衰期较快，但是鸡蛋中残留的氯霉素最快需要12 d才可以完全消除[1-3]。因为氯霉素具有较强的毒性，若长期食用氯霉素残留的鸡蛋会引起机体因正常菌群失调而更易感染疾病。2019年中国农业农村部第250号公告修订了食品动物中禁止使用的药品及化合物清单，氯霉素及其盐、酯类再次明文规定禁止使用，说明食品安全检测中氯霉素的残留问题进一步得到重视[4-6]。为满足食品安全快速检测和重大活动保障的相关诉求，有必要开发出适合于鸡蛋中氯霉素的快速测定，进一步加强市场管理和监督[7-9]。

鸡蛋中氯霉素的仪器检测法为气相色谱—质谱、液相色谱—质谱/质谱，此方法适合于监管部门对于样品的周期性检验检测，设备成本和维护成本都较高[10-12]。而目前中国基层检验检测水平能够实现大型仪器检测农兽药残留较少，即使购买了大型仪器也存在缺少专业技术人员等其他因素导致仪器不能投入使用，若在基层大力推进食品安全快速检测，可实现大量农副产品的有毒有害物质检测，将食品安全的风险降至可防可控水平，及时守卫餐桌安全。目前检测氯霉素的快速检测方法主要是胶体金免疫分析法，其原理是根据抗体可特异性识别目标分子实现检测，但鸡蛋中农兽药残留多为小分子物质，由传统化学方法得到的目标半抗原后再进行动物试验，这对于及时应对突发食品安全事件不具有时效性[13-15]。核酸适配体是可在体外进行筛选的一种比抗体更加稳定、高效的人工抗体，目标小分子通常结合于适配体的折叠区域，通过掌握核酸适配体的筛选技术可以快速应对突发事件，能大幅提升基层检测机构应对食品安全未知风险的能力[16-18]。

近年来研究食品中氯霉素残留的适配体检测方法主要有比色检测法、荧光检测法、化学发光检测法和生物传感检测法等[19-21]，比色检测法较其他在可操作性及便捷性等方面更适用于现场快速检测[22-24]。例如，Yan等[25]基于生物素—链霉亲和素信号放大测定氯霉素残留；Huang等[26]基于DNA酶功能化纳米探针催化显色用于快速检测氯霉素；高慧菊等[27]基于氯化钯纳米颗粒标记聚合物螯合物的双重信号放大快速检测氯霉素；Mahbobeh等[28]利用金纳米粒子在不同状态下的显色反应间接检测氯霉素残留量。由此可见，以适配体特异性识别结合显色反应是目前现场快速检测的最佳方法，目前适配体比色法通常会利用生物酶、金属纳米粒子实现转导，在温育反应和分离洗涤等操作过程中比较繁琐，易出现假阳性结果，不利于现场快速检测的有效分析。研究拟将杂交互补链反应与显色反应同时应用于适配体传感器，建立一种快速检测氯霉素的新方法，通过引入DNA酶及磁性纳米微球实现简化操作及减少假阳性结果的产生。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

氯霉素、氟苯尼考、恩诺沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、多西环素、甲砜霉素：USP级，德国Dr. Ehrenstorfer公司；

氯化血红素(贮藏温度2～8 ℃，hemin)：国药集团化学试剂有限公司；

羧基磁珠(1.0～2.0 μm，10 mg/mL)：赛默飞世尔科技公司；

DNA酶(1)(5’-GGGTAGGGCGGGTTGGTGGGACAACTCACTGAAGGACATGTA-3)、适配体(2)(5’-NH2-(CH2)6-ACTTCAGTGAGTTGTCCCACGGTCGGCGAGTCGGTGGTAG-3’)：上海生工生物工程股份有限公司；

紫外可见分光光度计：T6型，北京普析通用仪器有限公司；

恒温混匀仪：YN-H02-024型，杭州佑宁仪器有限公司；

16位磁力架：DynaMag-2型，赛默飞世尔科技(中国)有限公司；

三重四级杆液相—质谱联用仪：CN18063026型，沃特世科技(上海)有限公司。

1.2 磁珠—适配体的制备

将5 μL 20 mg/mL羧基化磁珠清洗2～3次，按照产品说明进行活化，以实现羧基化磁珠与氨基化适配体的偶联。向清洗后的磁珠中加入EDC/NHS活化剂(300 μL，2 mg/mL溶于50 mmol/L pH 6.0 MES缓冲液)，置于振荡器中室温反应30 min以上。活化反应后用缓冲溶液(50 mmol/L pH 7.5 Tris-HCl)清洗活化后的羧基磁珠，向清洗后的羧基化磁珠中加入氨基化氯霉素适配体(100 μL，3 μmol/L溶于50 mmol/L pH 7.5 Tris-HCl)，将上述混合物置于已调至37 ℃的恒温混匀仪中反应50 min，重复磁珠的清洗操作，再重新分散于300 μL pH 7.5的Tris-HCl缓冲溶液中，于4 ℃保存。

1.3 检测条件优化

1.3.1 温育时间 在适配体浓度3 μmol/L，DNA酶浓度5 μmol/L，氯霉素浓度100 mg/kg，考察温育时间(30，40，50，60，70 min)对体系吸光度的影响。

1.3.2 反应时间 在适配体浓度3 μmol/L，DNA酶浓度5 μmol/L，氯霉素浓度100 mg/kg，考察温育时间(30，35，40，45，50，55 min)对体系吸光度的影响。

1.3.3 显色反应 在适配体浓度3 μmol/L，DNA酶浓度5 μmol/L，氯霉素浓度100 mg/kg，考察温育时间(5，10，15，20，25 min)对体系吸光度的影响。

1.4 均相反应

向离心管中加入990 μL 10 mmol/L pH为7.5的Tris-HCl(含1 mmol/L EDTA)，进一步向其中加入10 μL 5 μmol/L DNA酶，在恒温混匀仪中25 ℃震荡反应45 min后待用。取上述磁珠适配体溶液300 μL与1 mL 0.02 μmol/L DNA酶溶液混匀，37 ℃涡旋混匀反应90 min，磁分离后采用洗涤液和pH 7.0 Tris-HCl溶液交替洗3次，将该磁珠复合物重新分散于200 μL的pH 7.5 Tris-HCl缓冲溶液中4 ℃保存。

1.5 氯霉素的检测

取30 μL上述磁珠复合物与20 μL按一定浓度梯度配制的氯霉素溶液充分混匀后，在恒温混匀仪中37 ℃震荡反应50 min，磁分离后取上清液加入10 μL 1 μmol/L hemin充分混匀后进行显示反应。先向反应之后的溶液中加入60 μL包含有0.5 mmol/L TMB与0.5 mmol/L H2O2的25 mmol/L pH 5.0柠檬酸盐缓冲溶液，室温反应15 min，向反应体系中加入稀硫酸溶液(30 μ/L，2 mol/L)以终止四甲基联苯的显色反应。将反应体系静置10 min后，测定吸光度，并建立吸光度值与氯霉素浓度之间的线性关系。

1.6 氯霉素检测的特异性

为了验证方法的特异性，将浓度为100 mg/kg的氯霉素、氟苯尼考、恩诺沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、多西环素、甲砜霉素7种抗生素按照1.4的步骤加入到磁珠复合物中混匀，进行显色反应后使用分光光度计测量。

1.7 鸡蛋样品的准备

鸡蛋样品购于当地超市。称取10 g搅拌均匀的样品于50 mL具塞离心管中，加入1.0 mL 10 ng/mL间硝基氯霉素标准溶液和30 mL乙酸乙酯，振荡30 min，4 000 r/min 离心2 min后取上清液转移至圆底烧瓶中，残渣用30 mL乙酸乙酯再提取一次，合并提取液，于35 ℃ 旋转蒸发至1～2 mL，加入1 mL甲醇溶解提取液，用20 mL 4%氯化钠溶液和20 mL正己烷液液萃取，弃去正己烷层，水相用40 mL乙酸乙酯分两次萃取，合并乙酸乙酯相于心形瓶中35 ℃旋转蒸发，用氮气缓慢吹干备用。

2 结果与分析

2.1 检测方法原理

试验拟将模拟过氧化物DNA酶引入鸡蛋中氯霉素的适配体传感器，当氯霉素适配体与磁珠组合体结合后，可与DNA酶发生杂交链互补反应，从而使催化活性呈失活状态。加入不同浓度氯霉素目标分子后，具有高催化活性的DNA酶得到释放，试验体系可催化四甲基联苯胺—双氧水显色实现对鸡蛋中氯霉素残留的快速检测，整个试验过程原理如图1所示。当溶液中存在氯霉素时，复合物体系优先与氯霉素结合，使模拟过氧化物DNA酶从复合物体系中解离出进入上清液中。根据加入氯霉素含量的多少确定颜色变化，据此实现鸡蛋中氯霉素的定量检测。

2.2 DNA酶催化显色反应及磁珠适配体的建立

根据模拟过氧化物DNA酶的催化活性因与目标分子适配体杂交结合后得到抑制的磁珠结合体，可通过改变DNA酶的序列结构使催化活性的抑制效果提高。试验通过在DNA酶序列的3′末端增加一个A-碱基与未修饰的DNA酶在相同条件下分别与氯霉素磁珠适配体反应，在最优化反应条件下加入100 mg/kg氯霉素标准溶液反应后进行显色反应。如图2所示，因氯霉素与DNA酶竞争适配体，导致DNA酶与适配体解离。针对不同试验阶段的杂交反应分别进行验证分析，DNA酶和适配体(泳道3)与DNA酶(泳道1)、适配体(泳道2)相比电泳迁移速度较慢，证实DNA酶和适配体杂交成功，泳道5与泳道1的重合则充分说明氯霉素与适配体成功结合。从图3可以看出，未修饰DNA酶a、修饰后的DNA酶b和氯霉素进行的显色反应相比较，发现以修饰后的DNA酶进行显色反应引起的吸光度响应效应强于未修饰的DNA酶。

图1 基于核酸适配体识别引起DNA酶释放比色分析原理示意图

为进一步证明氯霉素与适配体的结合，通过紫外—分光光度法验证适配体与目标物的结合。从图4可看出，空白的TMB-H2O2溶液无明显的紫外吸收峰(曲线a)，10 μL 5 μmol/L DNA酶、10 μmol/L hemin、TMB-H2O2溶液及终止液反应后在紫外图谱上出现了明显的吸收峰(曲线c)，磁珠适配体溶液300 μL与1 mL DNA酶溶液混匀反应后吸取上清液，加入显色剂后有较弱的紫外吸收峰(曲线b)，当将100 mg/kg氯霉素用于适配体反应后，所得溶液产物加入显色剂后也出现明显紫外吸收峰(曲线d)。这一现象证明了氯霉素加入体系反应之后与适配体结合释放DNA酶，从而使显色反应强度进一步提高。

1. DNA酶 2. 适配体 3. DNA酶和适配体 4. 适配体 5. 适配体和氯霉素

图3 不同物质反应前后吸光度的比较Figure 3 Comparison of absorbance before and afterreaction of different substances

a. TMB-H2O2 b. 空白试剂 c. 100 mg/kg氯霉素 d. DNA酶

2.3 检测条件优化

2.3.1 温育时间 由图5可知，随着第一次碱基互补配对温育时间的增加，磁分离之后的溶液在显色反应之后吸光度响应值逐步降低，说明磁珠上连接的适配体与DNA酶结合后，导致溶液中DNA酶含量减少，显色反应溶液的吸光度值也随之趋于减小，当温育时间>50 min后得到的吸光度值趋于稳定。故以50 min作为最佳反应时间。

2.3.2 反应时间 由图6可知，将100 mg/kg的氯霉素用于添加DNA酶的磁珠适配体，其吸光度信号响应随反应时间的增加而增加，说明DNA酶从磁珠适配体上解离的量逐步增加。当氯霉素与反应体系的温育时间超过45 min时，反应体系的吸光度值趋于稳定。说明氯霉素与添加DNA酶的磁珠适配体反应时间达到45 min时可反应彻底。

图5 温育时间对吸收光谱的影响

图6 反应时间对吸收光谱的影响Figure 6 The effects of reaction times on the absorptionspectral responses obtained

2.3.3 显色时间 由图7可知，当显色反应时间<15 min时，吸光度的响应值随时间的增加而增加，超过15 min后吸光度的响应值达到稳定。由此可见DNA酶与氯化血红素的充分反应时间为15 min，此时酶促反应也达到最大限度。因此，以15 min为显色反应最佳时间。

2.4 线性分析

在优化的条件(DNA酶与适配体的反应时间为50 min，氯霉素加入后的反应时间为45 min，显色时间为15 min)下，研究不同质量浓度氯霉素在试验设计方法下的吸光度。比色反应过程中，体系的吸光度值随氯霉素浓度的增加呈线性增加(见图8)，线性回归方程为：y=0.101 1+0.549 5 lgC，相关系数为0.998。

2.5 特异性

分别考察了氯霉素、氟苯尼考、恩诺沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、多西环素、甲砜霉素7种抗生素在该试验条件下吸光度的响应值。由图9可知，对目标分析物氯霉素的响应值较大，而在其他6种抗生素的很小。此结果证明该方法对氯霉素具有特异性，其他同系干扰物的交叉响应可忽略。

图7 显色反应时间对吸收光谱的影响

图8 吸收光强度与氯霉素的线性关系

图9 7种抗生素用于试验设计的方法后产生的吸收强度响应

2.6 准确性

按照GB/T 22338—2008《动物源性食品中氯霉素类药物残留量测定》对鸡蛋样品进行适当前处理后，用液相色谱—质谱检测基底之后，在基底中分别加入质量浓度为5，10，25 mg/kg的氯霉素，得加标样品，分别用试验设计的方法、液相色谱—质谱和酶联免疫吸附试验(ELISA)法对加标样品进行检测，结果见表1。由表1可知，3种方法的RSD分别为2.29%，4.07%，2.59%，回收率为98.4%～101.1%，通过计算3种方法分别所得结果的偏差后得出检测结果基本一致，将表中所得试验结果与加标量进行比较得出试验设计的方法的检测结果准确度较高。

表1 与标准和常规方法的比较及准确性试验结果

3 结论

基于适配体—磁珠复合体与氯霉素的竞争反应，以达到解离适配体与DNA酶的杂交结合，成功实现DNA酶与血红素的催化显色反应，可用于鸡蛋中氯霉素残留量的快速检测。结果显示，该方法对氯霉素的检测具有检出限低、选择性强、反应时间短等优势，因该方法未涉及较贵重的仪器而且操作简单易行，较适合基层检测机构用于现场快速检测，便于及时筛查出氯霉素残留超标的样品。