GSDMD介导的细胞焦亡在糖尿病视网膜病变中的研究进展△

黎晓冬 谢学军 宿晓娟 武海燕 何润西

Cookson最早以pyroptosis一词描述细胞焦亡，来源于希腊的词根pyro表示火或发烧有关的意义，ptosis本意为下降，在此描述程序性细胞死亡的炎症性质，同时表明这是一种与细胞凋亡、坏死不同的细胞死亡方式[1-2]。近年来确定了Caspase-1/4/5/11介导的GSDMD结构域间的裂解决定了细胞的焦亡，即在任何细胞系统中，GSDMD结构域都足以驱动细胞焦亡，是细胞死亡性质的决定性因素[3]。因此，细胞焦亡过程即为炎症小体激活Caspase-1/4/5/11 后切割GSDMD，形成的GSDMD-N 端裂解后致细胞膜孔隙形成、细胞内容物肿胀破裂流出后致细胞炎症性死亡。细胞焦亡是近十年的研究热点之一，在各个系统中的研究进展迅速，为多种难治性疾病带来了新的治疗思路，在眼部疾病中也有部分研究报道。本文主要对GSDMD介导的细胞焦亡在糖尿病视网膜病变(DR)中的研究进展进行综述。

1 细胞焦亡的主要分子机制

细胞焦亡是一种新发现的细胞程序性死亡的方式，目前研究显示其主要有两种不同的激活通路，一种是依赖于激活的Caspase-1切割GSDMD后诱导的高度炎症性溶解性的细胞死亡，称为经典细胞焦亡通路；在Caspase-1介导的经典炎症小体通路中，不同的病原相关分子模式或损伤相关分子模式分别激活相应的细胞质炎症小体传感器，即各类NOD样受体(NLR)蛋白，包括 NLRP1、NLRP3、NLRC4、AIM2和Pyrin，然后招募Caspase-1和接头蛋白凋亡相关微粒蛋白(ASC)形成炎症小体，随后触发其二聚化和Caspase-1蛋白水解转化为活性亚基p10和p20，激活的Caspase-1随后切割蛋白GSDMD形成孔洞，细胞内容物大量释放出来，同时分泌较多白细胞介素(IL)-1β 和 IL-18至细胞外，引起严重的炎症反应。第二种则是Caspase-4/5/11介导的非经典细胞焦亡通路，在非经典型细胞焦亡通路中，革兰阴性菌的胞质脂多糖(LPS)直接诱导小鼠Caspase-11或人Caspase-4/5的激活。激活的Caspase-11/4/5也可裂解GSDMD，裂解的GSDMD通过释放有功能的GSDMD-N端在质膜上形成孔洞[4]，同时Caspase-1被NLRP3-ASC结合体激活来切割还没有活性的pro-IL-1和pro-IL-18，从孔洞中释放成熟的IL-1β和IL-18，诱发细胞焦亡[5-6]。上述研究表明，GSDMD是两种激活通路的最终执行者，也是决定细胞焦亡的关键因素[7]。

2 GSDMD与细胞焦亡的关系

GSDMD是gasdermin 成孔蛋白家族中目前研究最为广泛和深入的一类蛋白，GSDMD位于染色体8q24.2。Saeki等[8]发现，GSDMD在上消化道的上皮细胞中表达。近年的研究发现，GSDMD在巨噬细胞、单核细胞[9]、中性粒细胞[10]、CDT8细胞[11]中也呈高表达。人GSDMD蛋白大约由480个氨基酸组成，含有能形成膜孔诱导细胞溶解的N端结构域(NTDs)：GSDMD-N端易位到质膜上，特异性识别某种酸性脂质寡聚化后，形成允许成熟的IL-1β和IL-18通过的内径为10～15 nm的孔[12]，多个孔洞引起细胞内外渗透压改变，细胞膜破裂；而其C端结构域(CTDs)通过分子内结构域关联抑制细胞杀伤[13]，通过将NTDs的“羟甲基异丙醇1-羟甲基异丙醇2环(β1-β2)”与CTDs中一个常见的疏水性囊袋结合，导致结构域界面的裂解，从而破坏了CTDs自抑制作用，促进了膜透性和细胞溶解，从而促进了细胞焦亡[14]；gasdermin家族其他成员的NTDs都具有裂解细胞膜形成孔洞的活性,其过度表达都会导致细胞发生焦亡[15]。

3 关于GSDMD 的抑制剂

坏死磺酰胺(NSA)是一种小分子化合物，作为GSDMD 的抑制剂，与Caspase-1抑制剂贝纳卡桑(VX-765)都能显著抑制皂苷Polyphyllin VI(PPVI)诱导的NLRP3炎症小体的激活[16]。实验证实，NSA在体外和体内通过GSDMD上的Cys191直接绑定到GSDMD，抑制p30-GSDMD的毒性及GSDMD-N端的寡聚，导致无法形成孔洞，抑制释放IL-1β和其他pore-mediated信号分子，这也意味着NSA能特异性地抑制炎症小体，从而激活下游的炎症细胞死亡，同时使其他固有信号通路保持完整和功能[17]。混合谱系激酶样域(MLKL)是一种致细胞凋亡坏死的具有N-末端4螺旋束(4HB)和假激酶结构域的多结构域蛋白，NSA也能通过结合MLKL的4HB结构域抑制细胞凋亡[18]。综合上述研究可见，NSA对研究细胞凋亡及GSDMD 介导的细胞焦亡有着十分重要的意义，尤其是为研究GSDMD 介导各个系统的炎症性疾病提供了有力的依据。

4 细胞焦亡在DR中的研究

DR最开始被认为是一种单纯的微血管疾病，现在被认为是一种多因素导致视网膜微血管改变的慢性炎症性疾病[19]。DR的特征是由于毛细血管阻塞、视网膜内微血管异常、视网膜新生血管(RNV)及动静脉吻合支形成等引起的视网膜血流障碍[20]。DR导致视网膜细胞的明显损伤，如视网膜色素上皮(RPE)细胞和视网膜神经节细胞的损伤。根据眼底病变程度的不同，DR可分为非增生型DR(NPDR)和增生型DR(PDR)。早期NPDR的特征是微血管瘤，周细胞减少和渗出物的分泌。PDR发生在晚期，主要以RNV形成为特征；炎症和血管生成是DR的两种主要机制，它们更多地是相互作用的，而不是单独的过程。然而，它们相互作用的潜在机制仍不清楚。新近研究发现，在糖尿病大鼠视网膜中，NLRP3过表达可诱导促炎细胞因子和VEGF表达的增加，故NLRP3炎症小体是DR炎症和促血管生成的潜在交叉点[21]；临床试验发现，DR患者玻璃体中存在炎症小体成分，随着VEGF水平的增加，Caspase-1和IL-18水平均明显升高，尤以PDR患者为甚[22]。Yin等[23]采用免疫组织化学方法观察到NLRP3、ASC和Caspase-1定位于视网膜神经节细胞层和内核层。同时，他们发现糖尿病大鼠视网膜中NLRP3、ASC、Caspase-1及其下游成熟分子IL-1β、IL-18的表达增加。在一项研究NLRP3炎症小体抑制剂MCC950的报道中，DR患者手术切除的增生膜中NLRP3、Caspase-1和IL-1β均有高表达[24]；这些发现证实炎症小体的激活诱发的炎症反应在DR中起重要作用。ATP激活的P2X7受体促进NLRP3炎症小体及其下游IL-1β的过表达，损伤高血糖状态下的视网膜血管内皮细胞，从而增加血管通透性[25]，因此，P2X7R有望成为抑制DR进展的一个新靶点。另外，活性氧(ROS)累积过多产生严重的氧化应激被证实是导致并加重DR的一个重要原因[26]，高水平的ROS与VEGF的表达上调有关，而VEGF是视网膜血管渗漏和RNV形成的主要调节因子[27]。严重的氧化应激可以诱导细胞焦亡的发生，Zhou等[28]研究证实，硫氧还蛋白相互作用蛋白在ROS释放条件下与NALP3结合并激活NALP3炎症小体后导致了细胞的炎症性死亡；最新研究证实，蛋白精氨酸甲基化转移酶5 (PRMT5)参与缺血和缺氧诱导的氧化应激和细胞焦亡，PRMT5被抑制后激活Nrf2/HO-1信号通路减弱ROS介导的细胞焦亡[29]。ROS介导的NLRP3炎症小体激活损伤RPE细胞，维生素D3[30]和非诺贝特[31]被证实能针对ROS以抑制DR发病过程中RPE的损伤，同时非诺贝特也能保护DR患者的视网膜血管内皮细胞免受脂质过氧化损伤[32]；有意义的是，研究表明，降低血浆中同型半胱氨酸水平能抑制高水平ROS诱导的氧化应激[33]，从而阻断视网膜血管内皮细胞焦亡[34]。适当的ROS产生的轻度氧化应激能促进细胞的修复，因此，如何控制视网膜内ROS氧化应激水平成为抑制DR进展的重要研究方向。此外，有研究证实，黄芩苷通过上调miR-223基因的表达可达到延缓RPE细胞焦亡的目的[35]。视网膜微血管周细胞(HRPC)的功能改变及缺乏是DR最早的病理改变之一。Yu等[36]在研究长链非编码RNA心肌梗死相关转录本抑制原发性人HRPC焦亡机制时，使用晚期糖基化终末产物修饰的牛血清白蛋白(AGE-BSA)来模拟DR环境，结果表明，AGE-BSA可诱导Caspase-1、GSDMD蛋白的活性裂解及IL-1β、IL-18和乳酸脱氢酶的释放，细胞活性降低，提示HRPC中出现GSDMD介导的细胞焦亡现象。

综上可知，进一步探索NLRP3炎症小体/GSDMD蛋白介导的细胞焦亡机制对研究DR的发病机制和开拓新的临床诊疗思路非常重要。

5 展望

细胞焦亡是一种新发现的程序性的细胞死亡方式，对于多种免疫相关的疾病是一把双刃剑。一方面，它有助于保护多细胞生物免受细菌、病毒、真菌等感染；另一方面，过度激活的细胞焦亡可能导致慢性炎症[5]。随着人们对细胞焦亡的分子机制、生理生化研究的深入，许多心血管、肿瘤等疾病有了新的治疗手段。在眼科领域，细胞焦亡也为眼科学者提供了新的研究和突破思路，但目前细胞焦亡在眼科领域研究较少，尤其是在DR方面的探索研究尚处于起步阶段，仍有许多问题亟待解决，但其前景值得期待。