长链非编码RNA调控不同来源干细胞成骨分化机制的研究进展*

林梓聪 刘建全 赵喆 李文翠 熊建义

肌肉骨骼疾病是全世界都面临的重大医疗问题，而有研究指出肌腱疾病约占肌肉骨骼疾病的30%；甚至在美国，仅2008 一年便有约200 万人因为肌腱问题咨询医生[1]。即便如此，经过治疗后的损伤肌腱也并不能保证恢复如初，极易遗留各种各样的后遗症，令患者痛苦不堪。肌腱病也称肌腱炎，常见的肌腱疾病包括肩袖肌腱炎、肱二头肌长头腱炎、髌腱炎和跟腱炎等，而肌腱炎不仅常见于职业运动员，也多见于重体力劳动者、护理助手等需要长时间、高强度使用肌腱的人群。另外，在肌腱修复的生理过程中，很容易出现因为肌腱修复失败而导致的肌腱钙化现象，极大地削弱肌腱本身的生物力学强度，使得患者后续的工作、生活及运动等受到极大影响。

以往有实验[2]证明干细胞（包括骨髓间充质干细胞、脂肪来源干细胞等）有一定的迁移能力，而肌腱病导致肌腱中产生的异常基质成分（如脂肪降解、粘多糖积聚、细胞变圆、软骨细胞表型、钙化）提示有非肌腱细胞迁移到受损部位，或是内源性或外源性的有多向分化潜能的干细胞分化成为非肌腱样细胞。

关于这其中的机制，众说纷纭。现有诸如经典Wnt 细胞信号通路、MAPK 通路及非经典Wnt 通路等学说，而长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）这一调控分子因其在众多生命活动乃至疾病进展中均发挥重要作用，近年来也成为遗传学，特别是表观遗传学的研究热点。但是关于lncRNA 是如何参与肌腱钙化的调控过程，至今尚未完全清楚。笔者认为，探索lncRNA 如何调控不同来源干细胞的成骨分化活动，可以加深我们对肌腱病肌腱钙化的认识，能更深入地阐述肌腱病肌腱钙化的发病机制，为肌腱病的治疗提供可能的新靶点。

1 长链非编码RNA 和微小RNA

长链非编码RNA（lncRNA）是指长度大于200 个核苷酸，缺乏开放读框的非编码功能性RNA。细胞中亦有许多种类的其他非编码RNA，但相较于微小RNA（microRNA，miRNA），Piwi 互动RNA（Piwi-interacting RNA，piRNA）序列保守性较高，lncRNA 序列保守性较低。也正因为如此，lncRNA 能通过多种不同的机制在不同阶段、不同水平调控相关基因的表达。哺乳动物基因组中4%～9%的序列产生的转录本是lncRNA，而相应编码蛋白的RNA，即mRNA的比例是1%左右。但是，与mRNA 相比，其表达的丰度并不高，lncRNA 主要在细胞发育、分化等特定阶段较多量地表达，以调控这些过程，具有明显的组织细胞表达特异性。以往许多研究[3-4]表明，lncRNA 在剂量补偿效应、表观遗传调控、细胞周期调控和细胞分化调控等众多生命活动中发挥重要作用，近年来是表观遗传学研究的热点。

miRNA 是一类内生的长度为20～24 个核苷酸的小RNA，是RNA 介导沉默复合体的组成部分，通过结合同源的3'UTR 区域来发挥其沉默靶基因表达的作用。从序列上来看，其具有高度的保守性及同源性；从生物学功能来看，miRNA 大量地参与调控人类约1/3 的基因表达，而这种调控作用可以使一类miRNA 调控多个基因的表达，也可以使多个miRNA 精准调控一个基因的表达。

2 长链非编码RNA（lncRNA）促进干细胞成骨分化

2.1 骨髓间充质干细胞

骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stemcells，BMSCs）是常用于研究干细胞分化机制的干细胞，这有赖于其多向分化性及可在体外表达多种目的基因的特性。因此，近年来，有不少学者利用骨髓间充质干细胞研究lncRNA调控其分化的分子生物学机制。

骨髓间充质干细胞的成骨分化过程有众多因子参与。Zhang等[5]的研究发现，骨形态发生蛋白-1（bone morphogenic protein-1，BMP-1）可以促进人骨髓间充质干细胞的成骨分化；而miRNA-29b-3p 可以抑制BMP-1 的表达；lncRNA NEAT1 可以通过结合miRNA-29b-3p 来促使BMP-1 表达并发挥其诱导骨髓间充质干细胞成骨分化的生物学作用。Wu等[6]学者则证明了在骨髓间充质干细胞中lncRNA DGCR5通过与miRNA-30d-5p 作用来上调Runt 相关转录因子-2（Runt-related transcription factor 2，Runx2）这种能介导间充质干细胞成骨分化的蛋白的表达，以此诱导间充质干细胞的成骨分化。

骨质疏松症是困扰中老年人及临床医生的一大疾病，其基本特点是骨量的进行性丢失。因此，近年有学者研究骨质疏松症下的骨髓间充质干细胞的成骨分化过程。Gao 等[7]发现miRNA-143 可以通过抑制成骨细胞特异性转录因子（osterix，Osx）的表达来抑制骨髓间充质干细胞的成骨分化。而lncRNA MALAT1 可以直接结合miRNA-143 使其失活，使Osx 表达增加，从而促进骨髓间充质干细胞的成骨分化。Shang 等[8]发现，在糖皮质激素处理过的大鼠骨髓间充质干细胞中，lncRNA TCONS_00041960 可以与miRNA-204-5p 及miRNA-125a-5p 作用，抑制它们的生物学功能，进而上调Runx2、Osx 及骨钙素（osteocalcin，OCN）等成骨因子的表达量、抑制过氧化物酶体增殖剂激活受体-（peroxisome proliferators-activated receptor-，PPAR-）等成脂分化因子的表达，以此来促进骨髓间充质干细胞的成骨分化并抑制其成脂分化。同样是研究骨量进行性流失的Li 等[9]学者发现lncRNA Bmncr 的过表达可以减缓实验小鼠的骨质流失，甚至可以改变细胞分化决定，逆转骨髓间充质干细胞的分化方向，将本分化向脂肪细胞的干细胞转变为分化向成骨细胞。他们认为lncRNA Bmncr可以在更高层次上调控骨髓间充质干细胞的分化。

Wu 等[10]发现，在一定的机械张力下，lncRNA H19 可以通过吸附microRNA-138，介导骨髓间充质干细胞的成骨分化顺利进行。Li 等[11]在针对废用性骨质疏松症的研究中发现了lncRNA H19 可能的调控通路：在编码lncRNA H19基因被敲除的UMR106 细胞（一成骨细胞系）中，成骨分化过程被抑制，而编码lncRNA H19 及Dkk4 蛋白的基因均被敲除的UMR106 细胞中，成骨分化过程却是被促进的；同时，在二者的Wnt 信号通路研究中，均发现了Wnt 信号通路的改变与成骨过程的改变是一致的。因此他们认为，lncRNA H19 与Dkk4 蛋白的相互作用，并通过Wnt 信号通路来调控废用性骨质疏松动物中的成骨分化过程。

对于骨髓来源的间充质干细胞，近年来的研究均认为lncRNA 或通过与miRNA 相互作用、或在细胞分化决定的层面参与干细胞分化的调控；而且，这些效应在骨质疏松症来源的干细胞上表现得更为明显。这或许能为以后更深层次的研究提供文献证据支持。

2.2 脂肪来源干细胞

Zuk 等[12]于2001 年首次在人脂肪组织中分离出脂肪来源干细胞。自此种具多向分化性、易得性和无免疫原性的干细胞被发现后，越来越成为遗传学、细胞学的研究热点对象。相应地，亦有越来越多的学者利用脂肪来源干细胞来研究其中lncRNA 参与调控成骨分化的机制。

以往有研究表明，白介素-6（interlukin-6，IL-6）等炎症因子可以提高Runx2 等成骨分化标记物的表达，从而促进干细胞或其他细胞的成骨分化。Wu 等[13]在其针对人类脂肪来源干细胞的研究中发现，miRNA-665 可以抑制IL6的表达，而lncRNA HIFA-AS2 可以通过结合miRNA-665，并激活PI3K/Akt 信号通路来上调IL6 的表达，调控脂肪来源干细胞的成骨分化。而Jin 等[14]在研究炎症环境下的脂肪来源干细胞时发现，肿瘤坏死因子-（tumor necrosis factor-，TNF-）和白介素-17（interlukin-17，IL-17）等炎症因子可以通过活化核因子B（nuclear factor kappa-B，NF-B）来抑制脂肪干细胞向成骨细胞分化；反之，炎症微环境及炎症因子也可以通过NF-B 信号来使lncRNA MIR31HG 的表达量上升，这会抑制脂肪干细胞向成骨细胞分化。

Yi 等[15]发现，人类脂肪来源干细胞在成骨分化过程中会表达更多的lncRNA MALAT1 和更少的miRNA-30。更进一步的研究显示，lncRNA MALAT1 是通过结合miRNA-30来促进Runx2 的表达，以此促进脂肪来源干细胞的成骨分化。Li 等[16]在利用脂肪来源干细胞进行研究时发现lncRNA MEG3 的表达量在其成脂分化时下降，而在其成骨分化时上升，且在编码lncRNA MEG3 的基因被敲除后，干细胞成脂分化被激活，而成骨分化则被抑制；结合体外细胞实验，他们推断，lncRNA MEG3 是脂肪来源干细胞向脂肪分化抑或是成骨分化的重要调节因子，通过调节miRNA-140-5p 的水平来实现调控。

类似地，近年来的研究显示lncRNA也可以通过与miRNA相互作用来调控脂肪来源干细胞的成骨分化过程。然而，与lncRNA 参与调控骨髓来源干细胞成骨分化过程有所不同的一点是，从文献所展示的实验结果来看，炎症环境及炎症因子（包括IL-6、TNF-及IL-17 等）是极为重要的一环，lncRNA、microRNA 和炎症因子共同调控在炎症环境中脂肪来源干细胞的成骨分化。

2.3 牙源干细胞

Gronthos 等[17]在2000 年分离出第一种牙源干细胞--牙髓干细胞后，陆续有7 种牙源干细胞被发现，并在后续大量实验中被证实它们可以表现出与其他来源的间充质干细胞相似的多向分化性，而这也为后续应用于治疗临床上多种疾病提供了另一个可能。前文提到lncRNA MEG3 在脂肪来源干细胞中可以通过与miRNA-140-5p相互作用来促进干细胞的成骨分化，然而，Deng 等[18]在研究人类牙囊干细胞的成骨分化时似乎有完全相反的结论，他们发现lncRNA MEG3 抑或是lncRNAEZH2 表达量的下降可以活化Wnt/ -catenin信号通路，并以此促进人牙囊干细胞的成骨分化。Wang 等[19]在研究牙周炎患者的牙周膜干细胞时，利用体外细胞实验发现lncRNA POIR 可以通过吸附miRNA-182 调控Forkhead 转录因子1（Forkhead box protein O1，Fox O1）的表达水平来促进牙周膜间充质干细胞的成骨分化。

Gu 等[20]也利用牙周膜干细胞在体外诱导其成骨分化，并成功识别出960 种差异性表达的lncRNA 和1 456 种差异性表达的circRNA。他们认为，这项工作可以为未来的牙周膜干细胞成骨分化机制研究工作提供更好的思路及数据库。

近年来的文献研究较少使用牙源干细胞作为实验对象，但研究成果显示同一类lncRNA在不同来源的干细胞中所充当的角色并不一致，甚至是完全相反的。这也提示我们在探讨lncRNA 参与干细胞成骨分化的调控机制这一问题时，需要严格限定细胞来源、lncRNA 种类等条件，否则可能得到有偏差甚至完全错误的结论。

2.4 利用数据库筛选可能的lncRNA 及miRNA 等分子

以上实验均是聚焦于细胞中的某一类lncRNA与下游调节因子相互作用，另有Huang 等[21]利用人脂肪来源干细胞在体外诱导其成骨分化，并在该过程中识别出了1 460 种表达量上升和1 112 种表达量下降的lncRNA。此外，他们还发现，若lncRNA H19 的基因被沉默，则会显著降低包括ALP 和Runx2 等在内的成骨分化关键因子的表达量，也就是抑制了脂肪来源干细胞的成骨分化。类似于Huang 等学者的工作，Xie 等学者[22]在利用强直性脊柱炎患者的间充质干细胞和正常人群的间充质干细胞进行体外诱导成骨分化实验时也筛查出520 种差异性表达的lncRNA和665 种差异性表达的mRNA，同时亦涉及到64 条有显著差异的信号通路。作者经分析后还发现lncRNA ZNF354A-A、lncRNA LIN54-1、lncRNA FRG2C-3 和lncRNA USP50-2 这4 种lncRNA 可能介导强直性脊柱炎患者体内异常间充质干细胞的成骨分化。

在细胞实验中不注重研究具体的某种或某些lncRNA如何参与调控干细胞的成骨分化过程，而是利用相关技术进行分析、筛选后得到可能参与调控分化的lncRNA 亦是近年来部分学者的研究热点。笔者认为，这一方法虽不能揭示某一具体的机制，但可以为后来的研究者提供一定的参考。

3 长链非编码RNA（lncRNA）抑制干细胞成骨分化

3.1 骨髓间充质干细胞

利用骨质疏松动物模型或临床标本研究其中骨髓间充质干细胞的成骨分化过程。

Feng 等[23]在研究中发现，lncRNA BDNF-AS 表达量的增加可以诱导骨髓间充质干细胞增殖分裂并抑制其成骨分化；但具体是通过何种通路进行调控的作者并无过多阐述。由于作者利用卵巢切除来建立绝经后骨质疏松症的动物模型进行实验，所以他们推测或许lncRNA BDNF-AS 是通过雌激素通路来调控骨髓间充质干细胞的成骨分化的，但这仍需要后续更多的研究。而Wang 等学者[24]同样利用卵巢切除来建立绝经后骨质疏松症的动物模型，给出了一个可能的答案。他们发现在卵巢切除动物模型及绝经后骨质疏松患者的骨髓间充质干细胞中，lncRNAMEG3 可以调控miRNA-133a-3p 的表达，并可与之相互作用来抑制骨髓间充质干细胞的成骨分化。

Jiang 等学者[25]在研究骨质疏松时发现在骨髓间充质干细胞在被诱导成骨分化时，lncRNA SNHG1 的表达量是下降的。进一步的实验证实，lncRNA SNHG1 可以通过p38MARK信号通路抑制p38 活性及骨髓间充质干细胞的成骨分化。同时作者也发现在人体内，lncRNA SNHG1 的低表达可以通过促进p38 的活化来减缓骨质疏松的进展，这或许能为将来的骨质疏松防治提供新的思路和靶点。同样研究骨髓间充质干细胞成骨分化过程中的p38MARK 信号通路，Zhang 等[26]发现，Runx2、OCN 等成骨过程中关键因子的基因表达会被lncRNA DANCR的过表达所抑制，如若编码lncRNA DANCR的基因被敲除，这些因子的表达会被活化，转而促进骨髓间充质干细胞的增殖及成骨分化。后续实验证实lncRNA DANCR 亦是通过p38MARK 信号通路来调控上述现象的。

近年来的研究结果显示，lncRNA 亦是通过与miRNA相互作用以抑制骨髓间充质干细胞的成骨分化，而这一过程也是在骨质疏松症中较为明显；此外，笔者认为，诸如Runx2及OCN 等成骨因子在这一过程中的作用亦是不可忽视的。

3.2 其他干细胞

Gong 等[27]观察到髋关节置换术后发生的假体周围溶骨改变中有关节假体磨损颗粒的影响，体外实验证实经过关节假体磨损颗粒类似物处理，间充质干细胞中发现了lncRNA PRCNR1 表达量增加，其可以通过抑制Runx2、Osx 和OCN等成骨关键因子的活性来抑制成骨分化。这可以解释髋关节置换术后出现的关节假体周围溶骨现象。Wei 等[28]在研究非创伤性股骨头坏死时发现，相较于骨关节炎患者及正常人，股骨头坏死患者的间充质干细胞中lncRNA HOTAIR 的表达量增加而miRNA-17-5p 的表达量减少。而编码lncRNA HOTAIR 的基因被敲除后，miRNA-17-5p 表达量增加，同时增加了Runx2 等成骨分化关键因子的表达。

临床上，许多疾病均能导致病变骨的骨量大量丢失，这种丢失的后果便是病变骨的生物力学遭到严重削弱，这对患者的日常生活是极为不利的。研究指出，某些lncRNA 在这其中亦是充当关键角色，笔者认为，这可以为以后研究针对这些疾病的新疗法提供思路及实验证据支持。

4 小结与展望

综上所述，作为表观遗传学研究的新晋热点，近年来有愈来愈多的研究针对lncRNA。正如前文所介绍的，lncRNA作为非编码RNA 家族的重要一员，在真核生物的生长发育过程中起到重要的调控作用。而且，大量研究表明，lncRNA可以在转录阶段、转录后翻译阶段及表观遗传修饰阶段调控相应的基因表达，从而在基因印迹、细胞周期及剂量补偿等生物学过程发挥其相应的调控作用。lncRNA 在干细胞分化过程中发挥重要的调控作用，许多lncRNA 与骨髓间充质干细胞、脂肪来源干细胞及牙源干细胞等的成骨分化过程有关，lncRNA 可以通过与一种或多种microRNA 相互作用以调控后续信号通路，进而调控干细胞成骨分化过程；而同一种lncRNA 在调控不同来源的干细胞成骨分化中，可以通过不同的信号通路起到截然相反的调控效应；某一些lncRNA甚至在此过程中扮演一个调控细胞决定的重要作用，可以左右干细胞的分化方向。

此外，这些研究大多数是以骨髓间充质干细胞这一类易获得，实验技术成熟的干细胞为实验对象，并有部分学者选择使用脂肪来源干细胞及牙源干细胞，以探究特定细胞成骨分化的调控机制。但是，鲜有学者关注到肌腱干细胞（tendonderived stem cell，TDSC）这一类较为冷门的肌腱组织内源性干细胞，更遑论对其成骨分化机制及其调控机制的探索。2007 年美国的Bi 等[29]首次在离体组织分离出TDSCs，Rui等[30]也于2010 年的报道中首次在大鼠活体肌腱组织中分离出了TDSCs；随后，许多学者也在其他种属生物肌腱组织中分离出了TDSCs。现已经证实，TDSCs 是一类广泛存在于诸如人类、大鼠、小鼠等不同种属生物体内的干细胞。这类干细胞可以在定向诱导的情况下，分化成为骨、软骨与脂肪等组织。而TDSCs 这类肌腱内源性的干细胞相较于骨髓间充质干细胞、脂肪来源干细胞及牙源干细胞等肌腱外源性的干细胞，可能对于解决肌腱病及肌腱钙化这一困扰大量患者的疾病有更直接的意义。

目前，关于lncRNA 对TDSCs 成骨分化调控机制的探索实验及其报道仍是少数，笔者认为，探索lncRNA在TDSCs诱导成骨分化过程中的调控机制，对于阐明肌腱病肌腱钙化发生过程中的分子机理具有重要意义，对未来肌腱病肌腱钙化的临床分子治疗发展可以提供新方法。