变应原体外检测技术研究进展

周小倩，井刚，王睿怡，张文远，王文静，唐小牛，孙恩涛

1．皖南医学院卫生检验与检疫学教研室，安徽 芜湖 241002； 2．皖南医学院医学寄生虫学教研室

变应原是指能够诱导机体产生特异性IgE(specific IgE,sIgE)抗体进而引起过敏反应的抗原性物质[1]。变应原引起的过敏性疾病是目前全球公认的健康问题，近年来，过敏性疾病的发病率呈上升趋势[2]。过敏性疾病广泛影响人们的生活，严重时可危及生命[3]。根据变应原引起机体发生变态反应的途径不同，可以分为食入性变应原和吸入性变应原等[4-6]。因此，明确变应原对于过敏性疾病的预防和诊疗具有重要意义。由于变应原体内检测存在安全风险等问题，变应原的体外检测逐渐成为近年来的研究热点。本文主要对变应原的体外检测技术进行了综述。

1 血清sIgE检测

目前，血清sIgE的检测已经被认为是最有效的体外变应原检测方法[7]。该检测方法能够避免体内试验可能出现的严重过敏反应，对患者绝对安全。检测方法主要包括放射变应原吸附试验、酶联免疫吸附试验、荧光酶免疫分析、纳米磁微粒化学发光法、免疫印迹法、液相芯片法等。

1．1放射变应原吸附试验(radioallergosorbent test，RAST) 1967年Wide等[8]首次建立了RAST，用于检测血清中sIgE。RAST基本原理是血清中sIgE抗体可以与固相载体上包被的变应原发生特异性结合，sIgE与放射性核素标记的抗IgE抗体反应，sIgE的含量与放射强度成正比关系，根据放射强度，在标准曲线上计算出sIgE抗体含量。该检测方法具有较高的灵敏度与特异度[9]，但由于核素具有放射性，容易造成环境污染，且检测成本高、周期长，同时还不适用于药物、细菌、真菌等变应原的检测，因此，相比于其他的体外检测方法，该方法的使用逐渐减少。

1．2酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA) 自从Engvall和Perlman在20世纪70年代首次报道建立酶联免疫吸附试验以来，由于ELISA具有快速、敏感、简便、易于标准化等优势而被广泛应用，并且随着方法的不断改进、材料的不断更新，尤其是基因工程技术、计算机技术的推动，使得制备包被抗原，针对某一抗原表位的单克隆抗体进行阻断等过程的特异性都大大提高。使用间接ELISA法检测血清sIgE[10]，其原理是将变应原包被在固相载体上，血清中的sIgE抗体可与相应的变应原发生特异性结合，sIgE再与酶标记的抗IgE抗体反应，最后加入酶的显色底物就可使反应体系显色，而颜色的深浅与sIgE的含量成正比，依据反应体系吸光度的变化，根据标准曲线计算出相应sIgE的含量。与RAST相比，ELISA对环境无污染，在一定的条件下，酶的活性较稳定，价格更便宜，结果重复性高[11]，具有较高的灵敏度[12]，检测范围广[13]。但是，完成一种变应原sIgE的检测需要50 μL血清[14]，因血清用量大，婴幼儿患者不太适用。

1．3荧光酶免疫分析(fluoro enzyme immunoassay，FEIA) 基于FEIA建立的检测系统以UniCAP为代表。UniCAP检测系统将变应原包被在一种与变应原有着较强结合能力的新型固相载体纤维素衍生物ImmunoCAP上。变应原捕获样本中的sIgE，再用β-半乳糖苷酶的多克隆和单克隆抗IgE抗体与sIgE结合，最后直接检测荧光，荧光强度与sIgE的含量成正相关。Angelo[15]使用该方法对韩国首尔中重度变应性鼻炎患者进行检测，结果显示该方法对中重度变应性鼻炎患者sIgE的检测水平最低为0．53 kU/L，而且检测过程主要由UniCAP100全自动检测仪完成。该仪器可检测500多种变应原，检测时间短，能够避免人为的操作误差，对技术人员的操作水平要求较低。该方法也是目前公认的检测sIgE的“金标准”[16]，对不同年龄段患者均适用，但仪器试剂昂贵，且每次试验只能检测一种变应原，检测成本高，不易在临床广泛开展。

1．4纳米磁微粒化学发光法(magnetic nanoparticle chemiluminescence immunoassay，NM-CLIA) 化学发光免疫分析(chemiluminescence immunoassay，CLIA)兴起于20世纪70年代中期，发展至今已经成为一种成熟先进的超微量活性物质检测技术，NM-CLIA是将纳米磁微粒技术与化学发光检测技术相结合建立起来的一种新型的检测血清sIgE的方法。该方法的基本原理是借助生物素-链霉亲和素生物放大系统，将变应原包被在径粒直径为100 nm的磁微粒上，用以捕获血清中sIgE，而sIgE会与辣根过氧化物酶标记(HRP)的鼠抗人IgE抗体结合，最后HRP催化发光底物鲁米诺和过氧化氢脲，光信号的强度可被检测系统捕捉，进而计算出sIgE的含量。王琼等[17]用该方法检测腐食酪螨sIgE抗体，显示灵敏度达80．95%，特异度为100%。该方法最低检测限达pg级，还具有检测范围广、检测时间短、操作简单等优点。此外，该方法使用中国的变应原原料，检测成本低[18]，对不同的过敏性疾病人群均适用。

1．5免疫印迹法(immunoblotting test，IBT) 免疫印迹法是20世纪70年代末80年代初发展起来的蛋白质测定技术，其发明者为美国斯坦福大学的乔治·斯塔克[19]。该方法是将抗原抗体的反应固定在固相膜载体上，通过酶催化底物反应，使得固相膜上发生颜色的变化，进而对血清sIgE进行定量。基于该方法建立的检测系统以Mediwiss敏筛定量检测系统为代表。该系统使用了生物素亲和素放大技术，检测灵敏度较高，只需250 μL血清即可检测20多种变应原sIgE[20]。并且，Mediwiss敏筛检测系统与UniCAP检测系统均有很好的一致性[21]。此外，Mediwiss敏筛检测系统在过敏性疾病的变应原初筛、小儿食入性与吸入性过敏原sIgE检测方面有着广泛应用[22-23]，为小儿变应原初筛提供了新选择。

1．6液相芯片法(liquid phase chip method) 液相芯片技术是美国Luminex公司开发的一种多重多功能检测平台，液相芯片法将液相芯片技术与博敏达液相芯片反应动力学专利结合，利用这个系统可以对一个样品中的多种不同分子同时进行检测。这种检测技术是1997年被开发出来的[24-25]，其基本原理是将不同的变应原偶联在荧光物质编码的聚苯乙烯微球上，从而捕获血清中sIgE，生物素标记的抗IgE抗体可与sIgE结合，最后加入链霉亲和素标记的藻红蛋白。使用两种不同波长的激光照射经过检测仪通道的反应终产物，当微球和藻红蛋白都能检测到荧光信号才视为有效，分别测得各自的荧光值，根据荧光值可对sIgE进行定量检测[26]。液相芯片法只需50 μL血清即可检测常见的60多种变应原，灵敏度较高，最低检测限达3 pg/mL[27]，检测时间短，且对各年龄段患者均适用。

2 变应原直接检测的生物共振法

根据物质波理论，任何物质都伴随着波而存在[28]。生物共振技术的治疗基石是法国科学家德布罗意提出的量子物质波理论，该理论于1929年获诺贝尔奖[29]。该理论认为组成人体的各个器官也具有本身特有的物质波，如脑电[30]、心电[31]。在过敏性疾病发生时，不同变应原会引起不同波信号的改变，运用BICOM2000生物共振检测仪能够检测这些特异性的波信号，从而达到检测变应原的目的。BICOM2000不仅能够检测尘螨、花粉、化学物质、食物等490多种变应原，还能对药品进行快速检测[32]，适用于皮肤科、耳鼻喉科、小儿科、呼吸科、消化科等科室的临床诊疗工作[33]。该设备检测效率高，仅需20 min就能确定变应原，安全无创，简单快捷，患者易接受[34]。楼洁[35]用BICOM生物共振检测仪和UniCAP100全自动体外变应原检测系统对包括吸入性(尘螨)、食物性(花生、鱼类、桃)、真菌等7类变应原进行了检测，发现两者的检测结果相符合，且该方法对老年人或幼龄儿童的变应原初筛尤为适用。但由于该类检测应用了物质波理论，检测过程容易受到外界环境、操作人员、受检测人员自身干扰波影响，误差难以避免，且本仪器为手动操作，实验重复性差，较依赖操作人员的经验。目前，对于该方法使用存在较大争议，还有待进一步的验证。

3 结 语

本文对基于血清sIgE检测与基于变应原直接检测的生物共振法进行了综述。基于血清sIgE的几种检测方法各有优缺点。在检测费用方面，ELISA与RAST的检测灵敏度与特异度相当，但ELISA更无污染且价格合理；而UniCAP检测系统虽然是目前公认的血清sIgE检测的“金标准”，但是仪器较为昂贵，仅部分大型医疗机构有条件引进该检测系统，而且由于检测费用较高，主要适用于经济条件较好的患者。在检测速度方面，纳米磁微粒化学发光法检测时间短，结果可靠，重复性好，灵敏度达pg级；Mediwiss敏筛也只需250 μL血清即可检测20多种变应原sIgE，在小儿变应原初筛方面应用较多。其余检测方法，如液相芯片法虽具有高通量、检测范围广等优点，但对操作技能要求高；而生物共振检测法可以直接体外检测确定变应原种类，无任何痛苦，但检测结果不稳定，容易受到外界条件的干扰。因此，基于上述不同检测方法的优缺点，在临床诊疗中，医务人员可以为不同人群选择合适的变应原体外检测方法。综上，过敏性疾病对人类生命健康的影响越来越广泛，随着体外检测技术的进一步发展，预防和诊治过敏性疾病将更加方便快捷。