椰子致死性黄化病综合防控技术规程

于少帅 朱辉 余凤玉 宋薇薇

(中国热带农业科学院椰子研究所/海南省院士团队创新中心 海南文昌 571339)

植原体是一类寄生于植物韧皮部、通过刺吸式口器昆虫传播的原核病原菌［1-3］。由植原体引起的植物病害尚无有效的治疗药剂，是植物的毁灭性病害，因此该类病害以防为主［1-3］。由植原体引起的椰子致死性黄化病是椰子产业的一种毁灭性病害，该病害传播快、致病性高、危害十分严重［4］。椰子致死性黄化病地理分布较为广泛，在美洲、非洲和东南亚等地区均有分布［4］。已有研究表明：引起椰子致死性黄化病的植原体种类较为丰富，包括16SrI（-B）、16SrIV（-A、-B、-C、-E、-F）、16SrXI（-A、-B）、16SrXIV、16SrXXII（-A、-B）、16SrXXXII（-B）等多个组或亚组［4-6］。

椰子是中国海南主要的特色作物，具有重要的经济、绿化和生态价值［7］。截止目前，椰子致死性植原体在国内尚未见报道，但海南是中国椰子主产区，椰子致死性植原体在中国的适应性分析和入侵中国的风险分析表明，中国为椰子植原体的适生区，华南沿海及海南大部分地区为中、高风险区［8-9］。结合前期研究基础和相关文献，总结、制定了由植原体引起的椰子致死性黄化病的综合防控技术规程，以椰子致死性植原体检测鉴定为基础，以防为主，在此基础上对椰子致死性黄化病进行综合防控，以期有效防控此类病害。

1 适用范围

本技术规程规定了椰子致死性黄化病防控过程中的术语和定义、分子检测技术、防控技术和注意事项等要求。

2 术语和定义

下列术语和定义适用于本规程。

2.1 植原体（Phytoplasma）

植原体是一类寄生于植物韧皮部、无细胞壁、尚不能人工分离培养的一类重要的原核致病菌［1-3］。

2.2 椰子致死性黄化病（coconut lethal yellowing diseases）

由植原体引起的椰子致死性病害，典型症状表现为成熟或未发育完全的果实脱落，叶片从叶尖开始向茎干的方向变黄，老叶先表现症状，最后是嫩叶表现症状，叶片最后从茎干上脱落［4］。目前中国尚未见该病报道，但分析表明中国为该病病原的适生区，极具被入侵风险［8-9］。

2.3 PCR扩增

聚合酶链式反应 （polymerase chain reaction， PCR） 是一种在生物体外放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术［10］。

2.4 巢式PCR

使用2 对PCR 引物对特定DNA 片段进行扩增。第一对PCR 引物扩增片段和普通PCR 相似，第二对PCR 引物结合在第一对PCR 引物扩增产物内部，第二次PCR 扩增片段短于第一次PCR 扩增片段，扩增结果更特异［10］。

2.5 综合防控

根据检测分析结果，采用物理清除、化学喷杀、水肥调节等综合技术措施对病害进行预防与控制。

3 巢式PCR检测

3.1 总DNA提取

样品叶片取样量为0.1 g，利用CTAB 法提取疑似发病椰子叶片的总DNA［11］，样品总DNA 提取方法参考天根植物基因组DNA 提取试剂盒说明书。

3.2 PCR扩增

引起椰子致死性黄化病的病原植原体采用植原 体 通 用 引 物 R16mF2/R16mR1［12］和 R16F2n/R16R2［13］进行扩增检测。将引物 R16mF2/R16mR1 扩增的PCR产物稀释50倍后用作巢式PCR模板，直接PCR 扩增引物R16mF2/R16mR1 扩增的植原体目的条带长约1 400 bp，巢式PCR 扩增引物R16F2n/R16R2扩增的植原体目的条带长约1 200 bp，PCR 扩增引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

3.3 PCR反应体系

PCR 反 应体系为 25 µL，包括 12.5 µL 2 ×PCR Master Mix （包含0.05 U/µLTaqDNA 聚合酶，4 mmol/L MgCl2和0.4 mmol/L dNTPs），上游引物和下游引物 （10 µmol/L） 各1.0 µL，1.0 µL DNA 模板，用ddH2O补至25µL。

3.4 PCR反应条件

反 应 条 件 ： 94.0℃ 5 min； 94.0℃ 30 s，53.0℃ 40 s，72.0℃ 90 s （第一轮 PCR） 或 80 s（第二轮PCR），共35个循环；72.0℃10 min。

3.5 扩增产物检测

PCR 扩增产物用SYBR Green I 染色，经1.0 %（w/V）琼脂糖凝胶、凝胶成像系统检测，将PCR扩增产物送测序公司进行测序分析。

3.6 序列编辑与鉴定

将获得的核苷酸序列采用DNA MAN 6.0 软件（Lynnon Corporation， Vaudreuil-Dorion，Quebec，Canada）进行编辑及多重比对分析。在NCBI 数据库进行 BLAST 分析 （https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi），明确所得核苷酸序列与GenBank数据库中已报道的椰子致死性黄化植原体相关核苷酸序列的同源性是否较高。利用MEGA 7.0 软件的邻接法（neighbor-joining， NJ）构建系统发育树［14］。将自展值（bootstrap value）设为1 000，用以评估软件生成的系统进化树的稳定性和支持率［15］，明确所得核苷酸序列与已报道的椰子致死性黄化植原体相关核苷酸序列的系统发育关系是否较近。根据序列同源性的高低与系统发育关系的远近，判断并鉴定椰子致死性黄化植原体及其种类等信息。

4 防控技术

4.1 把好种苗检测关

目前中国尚未见椰子感染致死性植原体的报道，椰子种苗的出入境检测十分重要。植原体最易通过苗木等材料传播，因此，应对外来的椰子苗木进行严格检疫，以防止椰子致死性植原体的入侵。

4.2 产地检疫

在椰子产地，应通过植原体通用型引物PCR扩增，加强对产地椰子果及其种苗的检验检疫，保证从椰子产地输出的果实、种苗等产品健康无毒，从源头上切断椰子致死性植原体的传播。

4.3 选育抗耐病资源

植原体病害目前尚无有效治疗药剂，因此，抗耐病种质资源的选育、应用是防控此类病害的根本措施。为防控椰子致死性黄化病，应通过对现有资源进行抗逆性评价鉴定、品种杂交、分子育种等选育椰子抗耐植原体资源，并在全球椰子种植区进行种植推广。

4.4 清除病源

加强田间管理，及时清理、烧毁椰子林中表现致死性黄化病症状的椰子树和苦楝、长春花、辣椒、细圆藤、山黄麻、蛇婆子等相关植原体寄主植物［16-20］，清除椰子林中的植原体传染源。

4.5 切断传播途径

根据不同地区不同椰子林中刺吸式口器昆虫的种类及其种群动态变化，确定喷洒杀虫剂的时间及周期，全面清除椰子园中的叶蝉类、粉虱类、蝽类等刺吸式口器昆虫［3］，预防植原体在椰子林中的传播。

4.6 水肥调节

在椰子种植过程中，在贫瘠的椰子种植区施用氮肥，在酸性土壤有效磷极低的情况下增施磷肥，在椰子果实发育初期增施钾肥，根据椰子种植园地情况适当浇水，以防止干旱对椰子生长的影响［7］。通过加强水肥管理，增强树体免疫力。

5 注意事项

5.1 扩大叶片取样范围

棕榈作物染病组织中植原体含量低，且分布不均。因此，在DNA提取时，应取尽量多的叶片粉碎混匀后，再称取0.1 g样品进行DNA提取。此外，植原体寄生于植物韧皮部，椰子等棕榈作物纤维组织发达，因此，在DNA提取时，应适当增加椰子样品的粉碎时间以便使样品充分粉碎、病原充分释放。

5.2 防止巢式PCR污染

巢式PCR 需要进行两轮PCR 扩增反应，在第一轮PCR 扩增反应结束后，需要对第一轮PCR 扩增产物进行稀释，以用作第二轮PCR 扩增的反应模板。在第一轮PCR扩增产物稀释过程中，要将扩增产物放4℃冰箱静置1 h 以上，在超净工作台上进行稀释，以防止产生污染，否则将影响第二轮PCR扩增反应的效果。

5.3 设置实验对照与重复

为保证PCR 扩增结果与测序结果的准确客观，在进行椰子致死性黄化病或疑似病害样品植原体检测过程中，应设置阳性对照和阴性对照。前期已检测到植原体的样品可作为阳性对照，去离子水和健康无植原体的样品可作为阴性对照，相关的阳性对照和阴性对照各设置1 个；并通过重复1～2次实验对PCR扩增结果与测序结果进行验证。