用于药物性胆汁淤积机制研究的体外模型

黄 龙， 吴 桥， 段钟平

1.首都医科大学附属北京佑安医院肝病中心 肝衰竭与人工肝治疗北京市重点实验室，北京100069；2.首都医科大学附属北京天坛医院感染中心

药物性肝损伤(drug induced liver injury，DILI)临床常见，胆汁淤积和混合性肝损伤是DILI的两种严重表现形式，有研究[1]表明，胆汁淤积性肝损伤近半数是由肝脏排泄到胆汁中药物或代谢产物引起。目前有多个理论来解释药物性胆汁淤积(drug induced cholestasis, DRIC)潜在的机制，但还远远不够，其原因之一是缺乏合适的体外预测模型。因此，本文就DRIC相关的一些体外细胞模型的研究作一概述。

1 以研究胆汁酸盐输出泵(bile salt export pump，Bsep)活性抑制作用的体外测定系统

Bsep是ATP结合盒超家族蛋白(ATP binding cassette，ABC)的一员, 负责转运胆汁酸盐，并定位于肝细胞胆小管侧膜。在将肝细胞内胆汁酸转入毛细胆管的过程中发挥着关键作用。研究[2]表明，胆汁淤积情况下Bsep蛋白表达下降，肝细胞内胆汁酸排泌减少，细胞内胆汁淤积程度进一步加重。因此,有研究[3]开发了一系列专门研究Bsep活性的体外细胞模型。

1.1 非洲爪蟾卵母细胞Gerloff等[4]首先研究了在非洲爪蟾卵母细胞模型中大鼠Bsep的转运蛋白功能。因为卵母细胞含有大量自身发育所需的蛋白质和营养物质，所以它们具有较低的膜转运活性基线。总的来说，爪蟾卵母细胞模型是研究基本转运蛋白的一个较好的单细胞系统。

在这项实验[2]中，爪蟾卵母细胞被大鼠Bsep的cRNA接种再进行培养，然后装载到细胞内放射性标记的牛磺胆酸(TCA)。结果显示，在细胞膜上表达Bsep的卵母细胞对TCA的转运比注入水的卵母细胞(对照)和表达多药耐药蛋白2(MRP2)的卵母细胞高1.5倍。说明了表达Bsep的卵母细胞模型是定量Bsep转运蛋白活性的有用系统。

此模型的优点：简单的细胞系统以及低基线的膜转运蛋白活性。缺点：(1)很难获得和推断出结果；(2)性能低下；(3)既复杂又费时。

1.2 表达Bsep的小管膜囊泡(canalicular membrane vesicles，CMV)通过适当的分离和制备，这些从肝脏分离出来的囊泡含有外排转运体，可以通过内膜向外(由内向外)定位，从而使外排转运体直接暴露于来自外部环境的受试化合物或药物。从具有多重耐药性的人口腔表皮样癌细胞和CHRC5细胞系分离的囊泡[5]，通过多耐药基因1(MDR1)转运体，初步探索了膜由内向外转运体在外排转运体研究中的应用[6]。这些实验中，存在ATP的情况下[7]，囊泡相关的TCA摄取增加，并随着TCA浓度的增加，囊泡内间隙的摄取达到饱和，出现一个主动转运介导的过程。这个过程使得从大鼠肝脏中克隆了一个P-gp家族蛋白(更名为Bsep)，该蛋白的功能在感染大鼠Bsep的Sf9昆虫细胞制备的CMV中得到证实。从肝组织中获得的CMV为Bsep功能活动提供了生理上合适的膜环境。然而，获得高质量CMV的难度和Bsep特异性的缺乏限制了该体外模型在常规筛选Bsep底物转运和/或抑制活性试验药物中的应用[8]。

此模型的优点：(1)提供了生理相关的膜环境；(2)较高的性能，易于使用。缺点：(1)高质量的CMV较难获得；(2)缺乏Bsep特异性。

1.3 表达Bsep的膜囊泡(membrane vesicles, MV)

MV是细胞膜碎片形成的脂质体结构。从杆状病毒感染的昆虫细胞中分离的倒置膜囊泡(Inside-out MV系统)是用于研究Bsep活性动力学、药物干扰和Bsep多态性的最常用体外系统。尽管如此，LLC-PK1、MDCK和HEK293细胞也可用于制备MV[9]。感染Bsep的昆虫细胞可以产生大量的转运蛋白。然而，从昆虫细胞系制备的囊泡具有较低的膜胆固醇含量，Bsep的活性对周围膜的胆固醇水平很敏感，但膜胆固醇对Bsep活性的影响尚不清楚。更具体地说，胆固醇只增加转运体Vmax，不影响Bsep对底物(Km)的亲和力。基于MV的Bsep转运蛋白分析通常通过不同的方法(如荧光BA衍生物检测、放射性检测或LC-MS/MS)测量受试胆汁酸在囊泡内的摄取，或通过基于ATP水解的比色法间接进行。在Pedersen等[10]的大规模研究中，此细胞系统用于评估250种化合物对TCA转运的抑制能力，并鉴定出86种Bsep抑制剂，其中38例与重度DILI相关。

此模型的优点：(1)具有高Bsep表达的系统；(2)适用于动力学活性的研究；(3)高性能，易于使用。缺点：(1)膜胆固醇浓度低；(2)对冻融循环敏感(Bsep活性低)。

2 用于DRIC研究的人肝癌细胞单层培养模型

HepG2细胞是应用最广泛的肝癌细胞系之一。HepG2细胞维持了一些关键的肝脏功能，它们能够合成和分泌血浆蛋白、甘油三酯、胆固醇，甚至是脂蛋白的转运和代谢也可以正常进行，但由于HepG2细胞缺少转运胆汁酸盐的细胞膜泵(如NTCP)，造成其对于DRIC的预测能力有限。

HepaRG细胞是另一种研究胆汁淤积的肝癌细胞系。与HepG2细胞相比，这种细胞具有更高水平的胆汁酸转运蛋白，但与人原代肝细胞相比，这种细胞的胆汁酸转运蛋白水平仍然较低。因此，当考虑胆汁酸在DRIC中的重要性时，HepaRG比HepG2更具有优势[11]。HepG2和HepaRG细胞系的两个主要局限性是它们来源于单一的供体并且是永生化的肝癌细胞。

此模型的优点：(1)容易培养；(2)腺病毒感染允许以不同比例控制胆汁酸转运蛋白的表达，从而可以进行胆汁酸转运调节的机制研究。缺点：(1)一些药物代谢的表达较低；(2)肝癌细胞来源于单一的男性捐献者，这限制了它们在特殊研究中的使用；(3)主要的胆汁酸转运体和胆汁酸合成能力非常有限。

3 用于DRIC研究的原代人肝细胞(primary human hepatocyte, PHH)三明治培养模型

原代肝细胞及其培养物来自新鲜分离的肝组织，它们可以很好地反映肝脏的体内情况。一般通过两步胶原酶灌注技术从切除的肝组织中分离出PHH。当种植在塑料细胞培养皿上时，无论是否包覆一层细胞外基质(ECM)，PHH在体内均会迅速失去其典型的形态和功能分化特性[12]。为解决这种情况，可以通过在两层ECM培养细胞来抵消，从而产生所谓的三明治培养系统(sandwich cultured primary hepatocytes，SCH)[13]。在这种构型中，培养的肝细胞保持其具有顶区和基底区的极化表型，后者与ECM支架直接接触。三明治培养的肝细胞不仅有代谢活性，并且具有能够适当定位的药物转运体以及功能正常的胆小管轮廓。因此，它们经常被用于评估外源物质的肝胆处置和基于药物转运体的药物间相互作用[14-15]。

此模型的优点：(1)易恢复细胞极性；(2)存在细胞-ECM间相互联系；(3)有助于功能性胆小管网络的形成；(4)维持转运蛋白和异种代谢酶的功能表达水平；(5)可用于胆汁淤积的定量和检测。缺点：(1)低氧环境；(2)由于有毒代谢物的累积，需要每天更新培养基；(3)较难在96孔板中进行培养。

4 用于DRIC研究的球状培养模型

3D球状培养是一种用无支架的方法来维持原代肝细胞的功能并且可以增强HepG2、HepaRG细胞的功能，其依赖于细胞自组装促进肝细胞再聚集，从而在球状培养物中产生3D构型，为防止细胞粘附，可以通过将细胞播种在非粘附基质上从而获得球状培养物，这种方法可使肝细胞在几天内自发聚集。 HepG2、HepaRG细胞或PHH的球状培养物分别可保持至少3周或5周的功能稳定性，且可保持包括药物代谢能力等内源性肝功能[16]。球形培养物用于检测长期胆汁淤积的效果。实际上，长期反复给药可大大提高在球体模型中培养的PHH对肝毒素的敏感性。除了鉴定胆汁淤积化合物外，还成功利用球状模型概括并鉴定了DRIC的潜在机制[17]。有研究[18]报道称，将非实质细胞掺入原代肝细胞球体培养物中，会产生与体内肝微环境更相似的细胞环境，尤其是各种细胞间的相互接触。因此，非实质性肝细胞，例如肝窦内皮细胞、肝星状细胞和Kupffer细胞，不仅支持并改善了原代肝细胞的功能，同时促进了球体培养中的炎症反应。因此，球状共培养物有部分能力可以在体外检测免疫系统在DRIC中的作用以及研究特异性DILI所涉及的机制。

此模型的优点：(1)适合长时间暴露；(2)易恢复细胞极性；(3)存在细胞与ECM，细胞与细胞之间的联系；(4)维持转运蛋白和异源代谢酶的功能表达水平；(5)可用于胆汁淤积的定量和检测。缺点：(1)通常需要特殊设备；(2)难以控制多种细胞类型的精确空间排列；(3)根据方法的不同，球体培养可能很耗时。

5 Upcyte方法扩增人肝细胞

HepG2和HepRG细胞系的两个主要限制是它们来自单一的供体和永生化的肝癌细胞。另一方面，SCH的一个重要限制是它们的供应有限，而且由于转运蛋白和CYP酶的功能从第4天开始稳步下降，它们可以使用的时间很短。于是，科学家引入了扩展PHH的新方法。可以在实验室中培养人体肝细胞，这种方法能够为人肝细胞(Upcyte®)提供有限的增殖能力，并保持PHH的关键表型特征，例如极化、胆汁酸的产生和分泌，以及细胞色素P450蛋白(CYP450)、UDP-葡萄糖醛酸转移酶和硫酸盐转移酶活性[19]。根据德国癌症研究中心(DKFZ)对人乳头状瘤病毒(HPV)开展的早期工作，研究团队[20]证明了HPV E6和E7 蛋白的弱表达能将肝细胞从细胞周期阻滞中释放出来，并使得肝细胞增殖以应答Oncostatin M(OSM)，OSM是白细胞介素6(IL-6)超级家族的成员，参与肝脏再生过程。研究人员通过细致筛选只对OSM应答的增殖肝细胞。OSM刺激引起细胞增殖，倍增时间为33～49 h。去除OSM 会造成生长抑制，4 d内发生肝脏分化，产生高功能的细胞。这种方法，称为Upcyte过程，能将人类肝细胞扩增35倍，每个肝脏可分离出万亿个细胞。相比之下，健康器官仅能分离出十亿个细胞。这一方法的发现优势在于可以从多个供体中扩增肝细胞，促进患者变异和特殊毒性的研究[20]。研究人员从可连续遗传的种族多样背景中生成肝细胞线，同时保持与重要人体肝细胞相同水平的CYP450活性、上皮分化和蛋白表达。重要的是，增殖肝细胞对23中不同药物呈现出与PHH相同的毒理学应答。研究还表明，与HepG2相比，Upcyte肝细胞表达更高的NTCP、OCT1、MRP3、MDR1和BSEP mRNA水平，并具有功能性MRP2、NTCP、OATP2B1和OCT1[19，21]。这些数据表明，Upcyte肝细胞作为体外筛选工具预测DILI和评估内源性药物清除率的优越性，以及它们作为体外系统用于药物性胆汁淤积研究的极高潜力。

此模型的优点：(1)扩增来自不同供体的原代肝细胞；(2)表达胆汁酸转运蛋白，形成胆小管；(3)与PHH相当的可测量的CYP酶活性，同时保持结合活性和关键的肝功能；(4)结合了PHH表型和易于操作的HepG2细胞的优点。缺点：(1)在长期三明治培养和球形培养中的使用需要进一步验证；(2)用于预测新药的促胆汁淤积潜力应进一步验证。

6 用于DRIC研究的肝切片体外模型

从1980年开始，由于机械组织切片机的发明，该项技术得到迅速普及。这种方法可以产生薄且损伤最小的肝切片，可以给其提供足够的营养和氧气交换，被称为精确切割肝片(PCLS)[22]。肝切片代表了一个实体模型，该模型中所有肝脏内细胞类型的存在对于毒理学研究具有重要价值[23]，因为Kupffer细胞、内皮细胞、肝星状细胞和胆管上皮细胞均参与了许多不良结局的发病机理，包括炎症、坏死、纤维化、胆汁淤积等。因此，可用于多细胞急性毒性研究，用胆汁抑制化合物和胆汁酸一起孵育肝精准切片作为DRIC体外模型[24]。此外，对胆汁淤积性药物暴露的肝切片的转录组学分析揭示了胆汁淤积相关事件机制的几个方面，包括体内类似的变态反应，以及诸如氧化应激、内质网应激、未折叠蛋白反应等过程，以及自适应响应等。最初认为，在新鲜PCLS中进行长期暴露或慢性毒性测试是不可行的，因为在建立模型后48～72 h内发生了细胞坏死，并且在6～72 h后(异源性)代谢酶的活性降低了[25]。但一项最新的研究[24]表明，在特定的细胞培养液中培养的人PCLS在5 d之内显示出生存能力的延长和功能的改善，从而使该模型可用于长时间的毒性测试，同时使得PCLS成为鉴定胆汁淤积生物标志物的合适模型。

此模型的优点：(1)可以合并多种细胞类型；(2)维持细胞极性；(3)存在细胞-ECM和细胞-细胞相互联系；(4)维持转运蛋白和代谢酶的功能性表达。缺点：有限的可用性。

7 干细胞来源的体外模型

干细胞来源的肝细胞体外模型的优势是可以克服PHH和肝癌衍生细胞的某些缺陷[26]，并且其在体外表现出自我更新的能力，同时保持了在多种细胞类型中分化的可能性。根据干细胞的来源和分化潜能，干细胞可分为胚胎干细胞和成体干细胞两大类。干细胞在体外可以根据体内肝胚胎发育的不同，通过连续暴露于生长因子、细胞因子等因素，向肝细胞样细胞分化。2006年，在成体细胞中首次诱导了多能性状态，产生了所谓的多能诱导干细胞(inducible pluripotent stem cells，iPSC)[27]。干细胞来源的肝细胞体外模型已显示出对多种类型的DILI建模有效，包括磷脂酰化和脂肪变性，以及家族遗传性胆汁淤积症等[28-29]。但在人类iPSC的转录组特征与在球体中培养的PHH的转录组特征之间发现了明显的差异。尤其是编码异源生物和内源性代谢酶的大多数转录物的表达均显著降低。虽然可以通过iPSC衍生的肝体外模型检测氯丙嗪和曲格列酮诱导的胆汁淤积性损伤，但与PHH的球状培养相比灵敏度较低，并且需要的浓度要比临床上使用的高得多[30]。在预测潜在的药物诱导的Bsep抑制作用时，目前认为这些人类诱导的肝细胞与PHH具有很好的相关性。然而与PHH相比，这些人诱导的肝细胞表达的Bsep水平显著降低。此外，它们还产生较少的结合胆汁酸，因此对结合胆汁酸引起的肝毒性的敏感性较低[31]。

此模型的优点：(1)简单易用；(2)无限寿命。缺点：(1)检测药物引起的胆汁淤积的敏感性低；(2)CYP酶和转运蛋白高表达水平，而代谢酶低表达。

关于DRIC的分子机制，有许多假设和推测仍需加以证明或澄清。在过去的10年中，有大量的研究致力于发展体外系统研究药物诱导胆汁淤积性肝损伤。目前已有多个用于监测DILI的先进的体外模型，它们属于两类，即肝源性体外模型和干细胞源性体外模型。干细胞来源的体外模型在研究不同类型的肝毒性，包括脂质积累方面显示了其价值。肝源性体外模型，如经典单层培养的肝细胞、PHH夹心培养、PHH或肝细胞球形培养以及肝切片，仍被认为是鉴别引起胆汁淤积性DILI最合适的体系。然而，DILI的表现通常是复杂的、多因素的。因此，需要新的体外测定法，其可在生理学相关的肝模型中全面评估化合物的胆汁淤积风险，我们团队前期创新性地构建了3D 组织工程肝脏DRIC体外模型，该模型利用大鼠的脱细胞支架和HepG2细胞在体外构建组织工程肝，用于检测氯丙嗪(一种常见的引起DRIC的药物)的毒性及相关机制。构建的组织工程肝脏中加入含混合胆汁酸盐的培养基和10 μmol/L的氯丙嗪在生物反应器中进行诱导培养，检测氯丙嗪引起的毒性改变及对一系列引起胆汁淤积的指标进行检测。通过实验证明该模型可以更好地模拟DRIC的病理特征，且由于模型采用人的肝细胞，因此种属差异性小，是一种良好的DILI细胞模型。

总之，每一种肝脏衍生的体外模型均有其自身的优点和缺点，因此，建议在研究和预测药物引起的胆汁淤积时联合这些系统。