内质网应激机制在非酒精性脂肪性肝炎中的研究进展

李童希，李西野，黄美州，钱保林，陈 浩，付文广

1.西南医科大学附属医院肝胆外科，四川 泸州 646000；2.西南医科大学临床医学院；3.西南医科大学附属医院(四川省院士专家工作站)

非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)是由非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)进展为肝硬化、肝细胞癌之前的必要环节，标志着NAFLD进入不可逆阶段。由于饮食和生活方式的差异，高碳水化合物饮食和高脂饮食更易导致肝脂肪的蓄积，西方国家中NAFLD的患病率明显高于东方国家[1]，然而随着我国经济的快速发展所带来的人群膳食结构的巨大改变，最新统计显示，2016年我国NAFLD患者约3 261万例，呈明显的上升趋势[2]。NASH正严重威胁着人类健康，患病人口众多，且随着我国肥胖人口的增加将必然导致NASH的发病率不断升高[3]，可能成为未来肝移植的最常见原因[4]。目前认为胰岛素抵抗、内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)、各种细胞因子、遗传多态性、脂肪毒性、肠道菌群等参与的“多重打击”学说是NASH最公认的发病机制理论。研究表明，长时间及过强的ERS会引起脂代谢紊乱及炎症，甚至可表现出纤维化的一系列病理损伤[5]，促进NASH的形成与发展。因此，本文将对目前前沿的ERS在NASH中的致病机制的研究作一概述。

1 ERS反应及其信号传导通路

内质网(endoplasmic reticulum，ER)作为一种有强大功能的核心细胞器，可参与大量蛋白质和脂质的合成与加工，也是将折叠正确的蛋白质运送到胞质或分泌出胞的重要场所。细胞可根据其所处的生理和环境条件来调节ER的蛋白质折叠能力，从而确保细胞膜结构蛋白的高保真合成和蛋白质分泌的功能。外源性物质、氧化应激、低氧以及内质网内腔非折叠蛋白的累积等情况均可改变内质网平衡，形成ERS，破坏ER的完整性[6]。而ER功能异常又将引起蛋白质折叠的异常，继而导致ER内继续出现未折叠或错误折叠的蛋白从而无法正常转运和分泌，这些蛋白集聚在ER内即可进一步加重ERS[7]。在这种情况下，ER内会建立一个控制系统处理应激态，即未折叠蛋白应答反应(unfolded protein response，UPR)会快速激活用于降低ER内的蛋白质折叠负荷。UPR主要由蛋白酶R样ER激酶(protein kinase R like endoplasmic reticulum kinase，PERK)、肌醇需求酶1(inositol-requiring enzyme 1，IRE1)、激活转录因子6(activating transcription factor 6，ATF6)三种跨膜蛋白介导。这些跨膜蛋白在生理状态下并不参与UPR反应，因其蛋白结合位点被B细胞免疫球蛋白结合蛋白/葡萄糖调节蛋白78(B-cell immunoglobulin binding protein/glucose regulated protein 78，BIP/GRP78)结合而并不暴露[8]。但ERS时，BIP/GRP78与三种跨膜蛋白分离，从而形成三种通路调节折叠蛋白的质量，感知错误折叠的蛋白积聚[9]，结合ER内积聚的蛋白，达到减少ER内蛋白质蓄积的目的。

ERS时PERK通路激活，从而引起真核起始因子2α(eukaryotic initiation factor 2α，eIF2α)发生磷酸化，进而可抑制蛋白质的翻译，减少蛋白质的生成，达到降低ER内蛋白质折叠负荷、减少蛋白质在ER内堆积的目的。同时，磷酸化的eIF2α还可通过增加激活转录因子的途径，选择性地增加C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein，CHOP)的翻译[9]。CHOP是一种在ERS的情况下通过诱导参与凋亡的基因来触发细胞死亡的主要转录调节物，且可能具有提前恢复因eIF2α磷酸化所抑制的mRNA翻译的功能[10]，因此与NASH的形成密切相关。

IRE1通路在ERS时的激活依赖于X盒结合蛋白1(X-box-binding protein 1，XBP1)mRNA的自身剪切。剪切后的XBP1进入胞核内，可通过促进GRP78的合成以及加强内质网蛋白降解两种方式减少未折叠蛋白的形成[11]，减少蛋白质在ER蓄积。同时，IRE1也可以结合肿瘤坏死因子受体相关因子2(tumour necrosis factor receptor associated factor 2，TRAF2)形成复合物，从而激活下游通路，产生氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)和核因子-κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)，进而引起胰岛素抵抗、炎症和细胞凋亡，参与NASH的形成。

ERS时ATF6通路也被激活，活化的ATF6从ER膜释放并转运至高尔基体，在高尔基体中加工后将进入细胞核与ERS反应元结合，激活GRP78、折叠酶、XBP1基因[12]，从而减少蛋白质蓄积，降低折叠负荷。同时，ATF6也能与IRE1通路中剪切后的XBP1结合，参与IRE1通路促进蛋白质折叠的过程[8，13]。

由此可见，ERS时建立的UPR其实是处理应激态，降低蛋白质折叠负荷的一种保护机制。但如果ERS过强或时间过长，UPR不足以缓解这种应激态时，这种保护机制可能对机体带来如脂代谢紊乱、炎症、细胞凋亡等负面影响，这些病理改变将使NAFLD进展，进而引起NASH。

2 ERS在NASH发病机制中的作用

肝脏是人体重要器官，作为人体最大的代谢场所，肝细胞中ER丰富，可分泌大量的蛋白质。因此，肝细胞中的ER功能至关重要，发生ERS将影响正常肝脏功能。而NASH是在NAFLD进展中出现严重的脂肪变性，另外还有肝细胞凋亡及点灶状坏死，此期可见部分区域的炎症和轻微纤维化(如门管区、窦周)，严重的NASH继续进展可能演变为脂肪性肝纤维化，甚至更严重的肝病。研究表明小鼠肝脏中BIP/GRP78的特异性缺失可引起ERS，最终观察到肝脂肪变性、肝细胞凋亡[14]；另外在NASH患者的肝脏和脂肪组织中均表现出ER稳态失衡[15]。Li等[16]建立的NASH模型中，肝脏的炎症因子及ERS相关的细胞凋亡蛋白表达增加，这些实验结果均提示，NASH中的ERS与炎症反应、细胞凋亡的发生存在必然的联系。因此，了解ERS在NASH分子机制中的效应对于NASH的诊治十分重要。

2.1 在NASH中引起脂肪代谢紊乱在NAFLD疾病的起始阶段，单纯性脂肪肝(simple fatty liver，SFL)形成，此期引起肝中脂质堆积的原因众多，包括极低密度脂蛋白分泌减少，游离脂肪酸氧化减少，乳糜微粒积累，脂肪组织分解减少或生成增加等途径[8，17]。这种脂质环境能加重ER内蛋白折叠的负荷，引起ERS。ERS又能造成一系列病理改变让SFL向NASH进展。研究表明，游离脂肪酸在引起ERS上发挥关键作用[18]；高脂饮食喂养小鼠的脂肪肝中发现了ERS[6]，也证实了这些异常堆积的脂质可激活ERS从而调节肝脂质的稳态。除了饮食脂质和脂肪组织来源的脂肪酸的大量涌入外，脂肪从头合成(De novo lipogenesis，DNL)的主要代谢产物饱和脂肪酸与ER应激信号通路的上调有关，这反过来使脂质代谢和胆固醇合成受到干扰，导致肝脂肪变性，成为NASH患者脂毒性和肝细胞ERS的主要驱动力[19]。

ERS发生时UPR信号通路将迅速激活，影响肝脏中的脂质代谢。研究表明，PERK通路能通过抑制促脂肪生成的酶以及促进脂质的磷酸化的方式调节脂质代谢[20]。高脂喂养的小鼠在肝组织中PERK和eIF2α表达明显升高，而CHOP上游的激活转录因子基因敲除的小鼠在高脂饮食下可以避免饮食引起的肥胖、肝脂肪变性和高脂血症[21-22]。这些实验结果均表明PERK通路在肝细胞的脂肪代谢中起重要作用，并与NASH的肝脂肪变性形成有关。IRE1α-XBP1通路也被发现参与肝脂肪代谢，此通路主要调节甘油三酯的合成和VLDL的分泌。若特异性敲除肝中IRE1α的基因，会使肝中的VLDL分泌减少导致肝细胞中甘油三酯堆积[23-24]。另外，特异性敲除肝中XBP1基因的小鼠也被观察到可以反馈激活上游，而使IRE1过度活化，表现出低脂血症以及肝脂质合成速率低。Ozcan等[25]已证实，ERS正是通过UPR的IRE1通路激活JNK，从而引起肝的胰岛素抵抗。胰岛素抵抗也是NASH发病的关键因素，一旦发生胰岛素抵抗可使脂质环境加重，将进一步引起炎症和细胞凋亡加重。因此，IRE1通路在NASH疾病进展与脂代谢中起到关键作用。ATF6也参与脂代谢调节。研究表明，ATF6通路可以促进肝脂肪酸氧化并遏制肝脂肪变性[26]。ATF6通路能在组蛋白去乙酰基酶-1(histone deacetylase-1，HDAC1)的协同下，与固醇调节元件结合蛋白2(sterol regulatory element binding protein 2，SREBP2)形成复合物而对SREBP2的转录产生抑制作用，进而对存在于肝细胞中的甘油三酯水平进行有效地调控[27]。有研究观察到敲除ATF6基因的小鼠发生ERS时，脂肪酸β-氧化、VLDL形成会被抑制，最终发生肝脂肪变性[26]。由此可见，在ERS条件下，UPR的三条通路均参与肝中脂代谢的调节。敲除PERK、IRE1或ATF6的任何一种跨膜蛋白，均能够导致小鼠的肝组织出现脂肪变性，这也表明在肝脏的脂肪变性过程中UPR具有重要作用。然而，先前的ERS研究集中在UPR上，但非UPR途径逐渐引起了研究人员的关注。非UPR途径包括GSK-3途径、PI3K/Akt途径等，它们通过脂毒性诱导的ER相关凋亡导致NASH的发展[28]。

2.2 在NASH中引起炎症炎症是NASH的基础病理变化，肝细胞内脂质的持续沉积会刺激巨噬细胞产生包括TNF-α、JNK、NF-κB及白介素6(IL-6)在内的过量炎症因子，导致肝脏的代谢性炎症[29]。在致炎的过程中ERS作用明显，UPR时IRE1-TRAF2复合物形成，从而激活释放重要的促炎症因子NF-κB和JNK，引起炎症的发生[30]。有研究观察到在缺乏JNK的小鼠中，促炎症因子的表达减少[31]。而NASH致炎的过程中NF-κB作为一种转录因子同JNK一样发挥关键作用[32]。研究表明，在NASH中UPR的三条通路均可激活NF-κB导致炎症因子表达的上调，使包括IL-6及TNF-α在内的炎症因子全身性的释放增加，促进炎症的发生[33]。另外，PERK通路主要通过间接释放核因子-κB激酶抑制剂(inhibitor nuclear factor kappa-B kinase，IKK)抑制IκB的方式激活NF-κB，而ATF6主要通过磷酸化蛋白激酶的方式直接激活NF-κB[34-35]。以上结论也证实了ERS中的UPR可以通过三条通路引起炎症，参与NASH发生发展。

2.3 在NASH中引起细胞凋亡NASH患者会表现出肝细胞凋亡增加。使用凋亡抑制剂治疗NASH可以有效地预防肝硬化及肝癌[36]。证明细胞凋亡是NASH发展的一个重要诱因和标志。ERS引起肝细胞的凋亡主要与JNK途径和CHOP途径相关。JNK途径不仅可导致炎症因子增多，同时，该通路还将对一种凋亡调节激酶(apoptosis signal regulating kinase，ASK)实现活化。此时JNK途径可通过调节B细胞淋巴瘤的家族蛋白诱导细胞凋亡[37]。如释放促凋亡蛋白，活化Bcl-2源拮抗杀伤蛋白(Bcl-2 homologous antagonist killer，Bak)以及Bcl-2关联X蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax)导致细胞凋亡。同时JNK也可以通过抑制抗凋亡蛋白(如Bcl-XL、Bcl-2)的方式启动细胞的凋亡程序[38]。另外，Caspase-12也发现可以被IRE1α-TRAF2复合物募集，参与到细胞凋亡中。研究表明，Caspase-12基因敲除小鼠在ERS条件下及四氯化碳诱导两种条件下均观察到了能够抵抗细胞凋亡的表现，也均得出了肝损伤较正常对照组小鼠显著减少的结论[39]。证明Caspase-12参与了ERS中细胞凋亡的机制。PERK及ATF6通路则可激活CHOP，CHOP也是引起细胞凋亡的重要因素。同JNK类似，ERS中CHOP可激活NF-κB，进而促进TNF、IL-8的分泌增加，CHOP也可通过调控B细胞淋巴瘤家族蛋白来诱导细胞凋亡[40]。但近年有研究观察到高脂饮食的CHOP基因敲除小鼠形成了比野生小鼠更大的肝损伤、炎症和肝细胞凋亡。这可能与CHOP基因敲除小鼠活化的巨噬细胞死亡减少导致积累在肝中有关[41]。除去JNK途径和CHOP途径，PERK信号通路还可使谷胱甘肽水平降低，导致活性氧积累,使得凋亡细胞数增加[42]。因此，UPR的三条通路引起细胞凋亡的作用是明确的，但CHOP在NASH发生发展中的作用仍不明确，可能既有预防NASH进展又有诱导细胞凋亡促进NASH进展的作用，有待进一步阐明。

2.4 在NASH中引起肝纤维化肝纤维化主要是由于肝星状细胞(hepatic stellate cell，HSCs)这种非肝实质细胞激活，从而增加了肝脏细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的产出，进而导致以间质胶原为主的物质沉积，最终使纤维形成[43]。而ERS也参与到纤维形成的过程中。目前研究认为，ERS可通过介导细胞凋亡、调节纤维化相关因子表达等途径促进肝纤维化的形成[44]。在酒精/四氯化碳肝纤维化小鼠模型中，抑制IRE1通路可有效阻断转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)的释放从而抑制HSCs的活化[45]。另外，在存在慢性肝损伤的情况下，PERK通路可通过增强TGF-β信号来维持HSCs的激活；也可通过下调核内异质核糖核蛋白A1(heterogeneous nuclear ribonucleoproteins A1，hnRNP A1)来促进肝纤维化的发生[46]，提示PERK通路也参与到促进肝纤维化的过程。近期文献报道，ATF6相关基因缺失的小鼠心肌细胞中，观察到成纤维细胞被过度激活，提示ATF6可能可抑制纤维化[47]。但ATF6通路对肝细胞纤维化的作用尚无文献报道，仍有待进一步研究。

3 展望

NASH已成为威胁公共健康的常见疾病，作为重要慢性肝病之一。尚缺乏特异性的治疗方式，且“多重打击”学说尚未得到完全印证。但多种研究已证明ERS与疾病的发生发展相关。ERS在NAFLD的脂质环境下将发生炎症、细胞凋亡、纤维化等病理改变而引起NASH，并可能向肝纤维化、肝细胞癌进展。综上所述，干扰ERS的发生、提高ER处理错误折叠蛋白的能力以及在ERS发生时抑制NF-κB、CHOP、JNK以及Caspase等的表达均可能成为控制疾病进展的方式，对于未来NASH的治疗具有重要的意义。