消化系统肿瘤液体活检研究进展

周鑫亚，燕书明，张萌萌，张婧怡，李 健

河南省人民医院消化内科 河南大学临床医学院 郑州大学人民医院，河南 郑州 450003

消化系统肿瘤是全世界肿瘤相关死亡的主要原因之一。目前，血清肿瘤标志物、影像学、内镜检查、组织病理学检查等传统方法，仍被广泛应用于包括消化系统肿瘤在内的肿瘤筛查，甲胎蛋白(AFP)、血清癌胚抗原(CEA)、血清糖类抗原19-9(CA19-9)等肿瘤标志物及影像学(超声、CT等)，对于早期筛查和诊断的灵敏性和特异性相对较低[1-2]。组织活检是临床肿瘤诊断的金标准，但其不能反映肿瘤的异质性，转移性肿瘤可能存在原发肿瘤中未检测到的突变[3]，即发生转移前将恶性细胞和基因组物质转移到循环中。大多数消化道肿瘤患者首诊时处于中-晚期，且有相对较低的5年生存率[3]。

液体活检定义为对非固体生物组织的取样和分析，例如血液和大多数其他体液(如尿液、唾液、腹胸水或脑脊液)。其代表一种快速和非侵入性的替代组织活检的方法，并对纵向评估肿瘤(消化系统肿瘤、肺癌等)的筛查、诊断和监测方面具有优势[3-5]。基于血液的液体活检包括分离和分析在血液中循环的肿瘤来源或与肿瘤相关的成分：循环肿瘤细胞(CTC)、细胞外泌体及肿瘤衍生的循环核酸，如循环肿瘤DNA(ctDNA)、循环肿瘤RNA(ctRNA)[1-3]。本文旨在总结有关液体活检技术在食管癌、胃癌、结直肠癌、胰腺癌和肝癌中临床研究的最新进展。

1 CTC

CTC从原发肿瘤实体或转移病灶脱落后，通过血管和淋巴管释放到患者的血液中，CTC被描述为原始肿瘤的种子，有可能生长成新的转移灶。大多数CTC会在数小时内死亡，只有小部分可达转移部位，并在临床症状出现前保持休眠状态，然后在适当条件下恢复，从而形成转移导致肿瘤发病[6]。业已证明，CTC计数在包括消化系统肿瘤在内的不同肿瘤中具有预后价值[6]。此外，CTC中基因突变和蛋白表达的信息是肿瘤筛查、治疗反应评估和生存预测的另一个重要标志，如结直肠癌(CRC)有体细胞遗传变异，包括单核苷酸变异(SNV)和较大体细胞结构变异(SSVs)[1-2]。

1.1 食管癌Reeh等首次报道食管癌患者CTC检测结果显示[6]，CTC阳性患者无复发生存期(RFS)和总生存期(OS)显著缩短。研究[6]表明，食管癌放疗后CTC检测的变化可预测RFS的预后价值，而与化疗药物无关；食管癌核苷酸切除修复交叉互补组1(ERCC1)表达与更好的新辅助放疗反应相关。2020年针对CellSearch系统检测CTC对食管癌患者预后价值的荟萃分析显示[7]，来自日本、德国和英国的7项2008年至2019年8组研究数据中包括405例食管癌患者，CTC阳性患者比率中位数为19.7%(13.2%～50%)，食管癌患者CTC阳性率与RFS和OS较短相关，且其对放化疗效果较差。

1.2 胃癌CTC数量变化可能是胃癌的早期诊断生物标志物。韩国一项包含116例胃癌患者和31名健康者的研究[8]显示，97.1%患者具有CTC≥2/7.5 ml均为胃癌，其诊断的灵敏性和特异性分别为85.3%和90.3%。CTC数量和表型也可用于监测肿瘤复发、远处转移和治疗反应。北京大学肿瘤医院的前瞻性研究显示[9]，临床病理特征相对较差胃癌患者术前和术后CTC较多。术后血液中CTC≥5/7.5 ml无病生存期(DFS)和OS明显较短。治疗后CTC数量增加也与早期复发有关。

一项胃癌患者CTC中程序性死亡受体配体1(PD-L1)表达研究显示[6]，50例(71%)观察到PD-L1+CTC。更高数量细胞表面波形蛋白(CSV)+PD-L1+CTC与生存时间短和治疗反应较差显著相关。胃癌患者外周血CTC和骨髓中弥散肿瘤细胞表面细胞角蛋白(CK)或CD44表型异质性研究显示[6]，41%(93例)患者血液或骨髓中均有CK阳性肿瘤细胞，10%患者发现表达CD44细胞。CK+CD44+细胞显著常见患者更易发生远处转移且与生存期显著缩短有关。

1.3 CRCCTC中遗传物质可作为CRC肿瘤诊断的生物标志物。Chen等[10]从90例CRC患者CTC中提取RNA，鉴定出具有高度差异表达率的上皮细胞转化序列2癌基因(ECT2)，AUC值为0.821；血清CEA浓度低于诊断阈值5 ng/ml的患者中该基因检测率也很高，ECT2表达可弥补当前CEA测试在诊断和监测CRC患者方面的不足。CTC检测在CRC中的预后价值有重要意义。Wu等[2]前瞻性研究评估CTC对CRC肝转移(CRC-LM)患者生存时间的影响，结论显示尽管完全切除，但术前存在两个或多个CTC与CRC-LM进展和低生存期相关。另一研究[6]发现，与无转移患者相比，CRC-LM患者外周血中CD133+和CD133+CD54+CD44+细胞亚群表达更高，腹部CT/MRI，CEA与CD133+CD54+CD44+细胞亚群结合可提高CRC-LM检测和鉴别率，其灵敏性和特异性分别为88.2%和92.4%。

Messaritakis等[11]在转移性结直肠癌(mCRC)患者中检测到癌胚抗原相关细胞黏附分子5(CEACAM5) mRNA阳性CTC细胞是PFS和OS缩短相关的独立预后因素。Kirsten鼠内瘤基因(KRAS)和鼠类肉瘤滤过性毒菌致癌同源体B1(BRAFV600E)突变患者中CEACAM5 mRNA阳性CTC的检测与较短无进展生存时间(PFS)相关。此外，与具有CEACAM5+/KRAS野生型肿瘤患者相比，具有CEACAM5+/KRAS突变患者OS明显更短。还有研究[6]发现，总CTC数量和显示间充质表型(mCTC)的CTC数量均与CRC患者晚期阶段和转移发生显著相关，高亮氨酸重复序列G-蛋白偶联受体5(LGR5)表达水平与转移发生显著相关。Konczalla等[6]在监测CRC患者CTC的SSVs变化中发现，可提供2～15个月(平均10个月)的时间来检测转移、复发，且SSVs检测术后复发的灵敏性和特异性均为100%。

1.4 胰腺癌胰腺癌患者CTC表型及数量研究提示与监测预后有关。Gemenetzis等[12]主持对胰腺导管腺癌(PDAC)CTC动力学的前瞻性纵向研究(CLUSTER研究，NCT02974764)鉴定出两种主要CTC亚型：上皮CTC(eCTC)和间充质CTC(mCTC)。接受新辅助化疗患者总CTC、eCTC和mCTC明显低于未经治疗符合前期切除条件患者；切除原发性肿瘤后，所有细胞亚型CTC负荷显著减少，但并未消失；所有CTC亚群术前数量是未化疗和新辅助治疗后患者术后12个月内早期复发的唯一预测因素。

Amantini等[13]发现，一线化疗前后，血液中高CTC数量是晚期PDAC患者OS和PFS不良的预后因素。发现CTC中有两个簇基因特征：第1个簇基因具有VEGFA、NOTCH1、EPCAM、IHH高表达，是胰腺导管腺癌(PDAC)患者化疗前的特征；第2个簇基因具有CD44、ALCAM、POU5F1B干细胞和多能性基因的高表达，是姑息性化疗后的表现，这些数据支持CTC特异性生物标志物的鉴定对改善晚期PDAC患者的预后和治疗的临床价值。

1.5 肝细胞癌(HCC)研究[5]显示，根据HCC患者CTC的大小和形态分离并计数CTC，表明HCC检测到CTC的存在和数量与较短生存期有关，提示CTC可作为AFP水平未升高患者的补充测试。有关HCC中CTC亚群的研究[6]显示，这些亚群基于细胞表面标记、RNA表达或基因组畸变而聚集，使用表面标志物检测具有肿瘤干细胞样或间充质特征的CTC具有预测肿瘤复发的临床价值。例如，HCC患者中glypican-3(GPC3)阳性CTC的存在与临床病理相关联，这些患者微小门静脉侵袭发生率较高，DFS和OS较低[5]。表达AFP的CTC也与HCC转移风险增加相关，而携带CNV(chr 8)的CTC预测生存率更差[6]。还有研究[2]发现，HCC复发组CTC、mCTC、混合CTC总数量均显著高于HCC非复发组，mCTC阳性与HCC早期复发呈正相关，并且mCTC阳性患者PFS显著缩短，这表明监测术后mCTC可能是HCC早期复发潜在的预测指标，而根除这些细胞可能为预防HCC复发开辟治疗途径。

除CTC生物学特性外，CTC的传播似乎也受到治疗影响。数据表明[5]，手术诱导的肝脏切除操作与CTC的释放有关。前路手术和传统手术的比较表明，后者与CTC的高释放及较差结局有关。约10%的肝移植接受者经历移植后肝癌复发，并导致几乎所有患者死亡，这与隐匿性转移瘤的生长或CTC植入有关[5]。Toso等[14]描述关注HCC患者原位肝移植过程中的5个步骤，以尽量减少CTC扩散进而降低复发风险：(1)选择CTC基线水平较低者，在接受形态学标准组合中加入生物标志物(如AFP或分子标志物)；(2)减少围手术期肝癌细胞的释放，对肿瘤进行细致的围手术期处理；(3)通过减少移植肝缺血再灌注损伤来阻止CTC的植入，这已被证明能促进癌细胞的植入和生长；(4)使用抗癌药物；(5)调节免疫以清除肝癌。

2 ctDNA

ctDNA通过主动和被动机制从实体瘤释放到血液中，后者似乎占主导地位，部分是由细胞坏死和凋亡引起的，且发生在肿瘤任何阶段，使ctDNA与其衍生肿瘤细胞具有相同的遗传信息，包括点突变、甲基化变化、重排、单核苷酸变异和基因拷贝数变异(CNV)[15]。与CTC相比，ctDNA半衰期相对较长，使其在反映肿瘤异质性方面具有优势。数量变化等定量信息和遗传缺陷等定性信息均是临床上ctDNA的监测目标[15]。

2.1 食管癌研究[16]显示，食管鳞癌患者血浆ctDNA水平显著高于健康对照者，其在TNM晚期及发生淋巴结转移患者中显著升高。食管癌不同类型存在甲基化ctDNA生物标志物的差异。研究[16]显示，术前高甲基化ctDNA(MSH2)的存在预示着209例所有阶段食管鳞癌患者DFS较短，而在所有阶段食管腺癌中，术前甲基化ctDNA(TAC1)与生存率无关。2009年一项研究24例食管鳞癌和35例0～Ⅲ期食管腺癌患者术前和术后评估DAPK和APC启动子甲基化[16]，术前存在DAPK甲基化与较差存活期相关，而术后检测到APC启动子甲基化与残留肿瘤相关；食管腺癌亚组结合术前APC和DAPK检测可显著提高区分短期(<2.5年)和长期幸存者的灵敏性和特异性。研究显示，食管鳞癌和食管腺癌在致癌机制与发展过程中差异显著不同：CCND1、NOTCH1、SOX2和/或TP63的基因组异常扩增在食管鳞癌较为常见，而食管腺癌中ERBB2、VEGF、AKRAS、GATA4和GATA6基因异常较为突出[15]。

2.2 胃癌ctDNA的数量或结构变化均与胃癌患者预后有关。Kim等[17]通过WGS分析监测胃癌术后ctDNA对癌症特异性重排的影响，发现25例胃癌中19例出现个性化癌症特异性重排。术后ctDNA的存在与手术12个月内胃癌复发显著相关。还有研究[15]显示，晚期胃癌标本中L1和SAT-α甲基化状态与静脉浸润或淋巴结转移、较短DFS及OS等临床病理参数相关。对胃癌中ctDNA染色体不稳定性与治疗前后的治疗反应研究[2]显示，93%对药物治疗敏感的患者有稳定的染色体，而52%对治疗耐药的患者则无，这表明检测ctDNA的染色体不稳定性可能有助于监测胃癌患者的治疗反应。

2.3 CRCCRC临床病理因素与ctDNA之间的有关研究显示，无论肿瘤分期、研究规模、肿瘤标志物、检测方法和样本类型如何，CRC患者ctDNA阳性与RFS和OS显著关联，CRC-LM患者ctDNA明显高于无转移患者，腹膜转移与ctDNA无关，但ctDNA与转移器官数量的关系存在争议[3]。Tabernero等[18]进行CORRECT Ⅲ期试验探讨ctDNA作为预后参数和mCRC治疗前突变检测的作用，166例mCRC患者接受安慰剂治疗，337例接受瑞戈非尼治疗。尽管患者间差异很大，但在安慰剂组和瑞戈非尼组中，高ctDNA浓度与较短中位OS和PFS相关。还有研究[3]显示，瑞戈非尼组血浆中存在KRAS突变患者PFS比无突变患者短，血浆中KRAS突变而非肿瘤组织中KRAS突变的预后价值已经得到确认。

在CRC手术或治疗后，即使无任何其他疾病临床证据，ctDNA检测也可能表明存在微小残留病(MRD)。Osumi等[3]前瞻性评估已切除Ⅱ期CRC患者ctDNA检测MRD能力，178例未接受辅助化疗患者中有14例(7.9%)术后检测到ctDNA，且11例(78.6%)随访27个月时复发；92.1%术后ctDNA阴性，仅有16例(9.8%)患者术后复发，化疗结束后ctDNA存在也与较短RFS相关。

研究[3]表明，组织中存在RAS野生型的CRC患者，以及血浆KRAS阳性和BRAF突变可抵抗EGFR抑制剂。ctDNA时程分析表明，在EGFR阻断期间，一些突变迅速出现，且通常可在放射性复发前检测到，例如抗KRAS突变克隆可出现在放射线确认疾病进展前检测长达10个月；在接受EGFR抑制剂治疗mCRC患者中检测到多个KRAS突变。接受EGFR抑制剂治疗患者的ctDNA时程分析表明，在EGFR阻断期间出现的KRAS突变克隆在EGFR抑制剂停用后下降，允许对EGFR抑制剂进行再激发治疗，从而再次导致应答[3]。

2.4 胰腺癌胰腺癌ctDNA甲基化可作为早期诊断的生物标志物。研究[4]显示，ADAMTS1和BNC1基因的甲基化可作为诊断和筛选胰腺癌的生物标志物，两基因组对Ⅰ期和Ⅱ期胰腺癌的灵敏性和特异性分别为94.8%和91.6%，与仅57.1%的CA19-9相比，两基因组AUC为0.95[4]。还有研究[4]显示，PDAC患者的半胱氨酸双加氧酶1基因(CDO1)高甲基化显著高于胰腺良性疾病患者，其区分PDAC和健康者的灵敏性为95%，比胰液细胞学(33%)或EUS-FNA细胞学(88%)更敏感。

此外，Berger等[19]研究PDAC中ctDNA最常见7个突变基因(TP53、SMAD4、CDKN2A、KRAS、APC、ATM和FBXW7)的检测数量，选择KRAS和TP53的组合突变等位基因频率(CMAF)反映ctDNA的数量，发现ctDNA中这些基因水平在治疗时明显降低，进展时明显升高；未经治疗患者中，治疗期间CMAF水平与PFS显著相关。

2.5 HCCCNV是肝癌发生的潜在驱动因素，其主要影响chr8和chr11。有关HCC检测ctDNA分析CNVs的研究提示[5]，HCC患者血浆中存在异常短和长的DNA分子群体。较短的那些优先携带与肿瘤相关的拷贝数发生畸变，该DNA片段约160 bp，且由凋亡癌细胞释放。

研究[5]显示，血浆CNV和SNV水平与HCC患者肿瘤负荷动态相关，两者在平均4.6个月成像前可检测到肿瘤发生，且优于AFP、AFP-L3%和脱-γ-羧基凝血酶原(DCP)的性能，ctDNA能够检测MRD并预测患者的RFS和OS，ctDNA与DCP结合可提高MRD检测的灵敏性。Oh等[20]针对HCC患者中cfDNA中的VEGFA扩增进行研究，假设它可预测对索拉非尼的反应。该研究发现，HCC患者使用索拉非尼未达到疾病控制患者cfDNA水平显著高于达到疾病控制的患者。尽管高浓度的cfDNA与较低存活率有关，但VEGFA比率并不是索拉非尼治疗反应的预测因子。

研究[5]发现，HCC患者血中检测到肿瘤相关基因(TERT启动子、TP53和CTNNB1和MLH1)突变与血管浸润有关，这些突变与更短生存期或更高复发率相关。一些研究确定与HCC预后相关特定基因的甲基化变化：LINE-1低甲基化和IGFBP7甲基化与较低生存率相关，而CTCFL低甲基化可预测较高肿瘤复发率和较低生存率[5]。此外，一项包括1 095例HCC的研究产生8种诊断和预后标志物的诊断预测模型(SH3PXD2A、C11orf9、PPFIA1、chr 17:78、SERPINB5、NOTCH3、GRHL2和TMEM8B)，除提供高诊断准确率外，该预测模型还与生存率相关[5]，这些发现证明ctDNA甲基化标志物在HCC的诊断、监测和预后中的实用性。

3 细胞外泌体

外泌体是磷脂双层纳米囊泡，直径30～150 nm，由包括癌细胞在内的各种细胞类型分泌且存在于许多生物液体中[21]。外泌体可利用各种机制进入受体细胞，如结合细胞表面受体、与质膜融合以及通过内吞作用内化。其包含一系列分子，包括蛋白质、脂质和不同类型的核酸，并通过生物活性载体的转移在细胞间通讯中发挥重要作用。外泌体数量及其核酸突变及蛋白质表达变化可用于肿瘤诊断和预后监测。

3.1 食管癌研究[21]发现，miR-93-5p可通过外泌体在食管癌细胞系EC9706细胞间转移，并可能通过PTEN/PI3K/Akt通路下调p21和Cyclin D1的表达，促进食管鳞癌细胞的增殖。还有研究显示[21]，Stathmin-1可通过外泌体传递而促进食管鳞癌细胞的迁移和侵袭，抑制Stathmin-1表达可增强鳞癌细胞系对多西他赛和辐射的灵敏性，其对食管鳞癌的侵袭性预示着预后不良。Ke等[22]在与食管腺癌衍生的细胞外囊泡共培养的Gastroids(胃类器官)中发现，来自Gastroids的外泌体miR-25和miR-210也可促进胃腺的增殖和细胞活力。

外泌体可能参与上皮-间质转化(EMT)相关的肿瘤转移过程。针对来自受照射T细胞的外泌体在体外表现出促进食管鳞癌细胞系TE13细胞转移的潜在作用，可能是通过调节β-catenin和NF-κB/snail通路促进EMT[21]。还有研究显示，TE2-CD63-GFP荷瘤小鼠血浆中发现GFP阳性小泡；同时收集SCC患者和非恶性患者血浆，显示SCC患者比非恶性患者具有更多外泌体，低水平外泌体显示预后不良[21]。

3.2 胃癌各种外泌体RNA和蛋白质已被确定为胃癌新的诊断和预后生物标志物。研究[2]显示，两个早期胃癌存在特异性外泌体lncRNA包括lncUEGC1和lncUEGC2，其在早期胃癌和胃癌细胞株的外泌体中显著上调。在鉴别早期胃癌和癌前疾患慢性萎缩性胃炎中，lncUEGC1的AUC值分别为0.8760和0.8406，高于CEA的诊断准确率。还有研究[2]发现，lncRNA-PCSK2-2∶1在胃癌患者血清外泌体中表达明显下调，其AUC为0.896，诊断灵敏性为84%，特异性为86.5%。诊断时AUC为0.732的胃癌患者外体lncRNA GNAQ-6∶1的表达水平较低。此外，Kumata等[23]研究发现，胃癌患者外泌体miR-23b水平显著低于健康对照组。外泌体miR-23b是胃癌每个阶段中OS和DFS的独立预后因素。利用胃液来源的外泌体DNA样本进行分析[2]，外泌体BARHL2基因甲基化水平有助于区分胃癌患者和非胃癌者，AUC为0.923。

3.3 CRC研究[24]显示，外泌体非编码RNA，如miRNAs、lncRNAs和circRNAs，已经证明在早期检测CRC的诊断潜力，其灵敏性和特异性高于CEA和CA19-9。与健康者相比，包括let-7a、miR-1229、miR-1246、miR-150、miR-21、miR-223、miR-23a和miR-301a等一些miRNAs在CRC被上调，且手术后明显下调，所有miRNAs的灵敏性均高于CEA(30.7%)和CA19-9(16.0%)。在CRC-LM患者中[24]，外泌体miR21高度上调，其OS或DFS短于那些外体miR-21水平低者。此外，外泌体PODXL和ECM1在CRC患者中的表达增加与预后不良有关，如远处转移和较短复发时间[24]。Kobayashi等[25]研究显示，CRC和高级别腺瘤患者的外泌体数量明显高于低风险病变(增生性息肉和低级别腺瘤)患者或健康对照组。此外，外泌体数量与典型病变大小、数量及两因素之和显著相关。

外泌体具有TNM分期特异性的预后潜力，可作为CRC最常用化疗方案(5-FU和FOLFOX)的预测标志物[24]。Yagi等[26]研究显示，CRC患者外泌体miR-125b水平显著较高，尤其是对mFOLFOX6化疗耐药患者。外泌体miR-125b水平可能有助于早期检测对基于mFOLFOX6的一线化疗的耐药性。此外，化疗前外泌体miR-125b是晚期/复发性CRC患者PFS的预测性生物标志物。

3.4 胰腺癌外泌体中RNA的异常表达提示胰腺癌早期诊断的潜力。研究[4]显示，含有外泌体8个长RNA的诊断组合(FGA、KRT19、HIST1H2BK、ITIH2、MARCH2、CLDN1、MAL2和TIMP1)在诊断PDAC时，以0.949的AUC识别可切除的Ⅰ/Ⅱ期肿瘤，且在区分PDAC与慢性胰腺炎(CP)方面表现出优于CA19-9的性能(AUC分别为0.931和0.873)。还有研究[4]显示，在PDACⅡ期患者中发现外泌体miR-451a显著上调，这些患者术后出现复发且OS和DFS较短。

Nakamura等[27]通过ERCP收集27例PDAC和8例CP的胰液样品研究显示，外泌体Ex-miR-21和Ex-miR-155水平将PDAC与CP患者区分的AUC分别为0.90和0.89。外泌体Ex-miR-21、Ex-miR-155水平和胰液细胞学的准确度分别为83%、89%和74%。当Ex-miR水平与胰液细胞学相结合时，准确度提高到91%。

3.5 HCC外泌体中RNA分子用于预测HCC的诊断与预后。研究显示[5]，血浆中高水平外泌体mRNA-hnRNPH1可鉴别HCC和慢性乙型肝炎患者，AUC为0.865。还有研究[5]显示，与慢性肝病相比，HCC中外泌体miR-10b-5p和miR-215-5p表达过高，血清外泌体miR-10b-5p诊断早期HCC的AUC为0.934；高水平外泌体miR-215-5p与DFS较差显著相关。此外，两种特异性外泌体lncRNA(ENSG00000258332.1和LINC00635)可区分HCC和慢性肝炎，其AUC分别为0.719和0.750，同时这两种lncRNA与血清AFP的结合可改善AUC至0.894[5]。

Lee等[28]在HCC患者中发现循环外泌体miR-21和lncRNA-ATB均与TNM分期和其他预后因素有关，包括T分期和门静脉血栓形成，该两标志物均与较短OS和PFS有关。研究[29]显示，HCC患者血浆中16个非编码RNA被证实显著上调，包括RN7SL1、SNHG1、ZFAS1和LINC01359。外泌体RN7SL1及其S片段具有较高HCC诊断准确率(AUC=0.87)。此外，RN7SL1S片段浓度较高是HCC生存率下降的独立因素，仅RN7SL1S片段可促进癌细胞增殖和克隆形成生长。

4 ctRNA

ctRNA已被发现存在于血循环中，且一定程度上具有作为癌症生物标志物的潜力。与DNA相比，循环中RNA不稳定，半衰期较短，因此，ctRNA主要检测目标是mRNA片段和miRNAs。此外，lncRNA、circRNA和tRNA衍生片段(TRF)在癌症诊断和治疗监测中具有新的生物标志物的潜力。外周血和其他体液中ctRNA的广泛分类和分布使其成为液体活检的优越生物标志物[2]。

4.1 食管癌研究[30]证明，非编码RNAs，如miRNAs和lncRNAs介导食管鳞癌细胞增殖和凋亡或相互调节细胞迁移和侵袭。miRNA通过直接与mRNA结合来控制食管鳞癌的发展而抑制mRNA翻译。研究[30]表明，miR-338-5p和miR-200c分别通过诱导肿瘤细胞凋亡和细胞周期阻滞来增强食管鳞癌的放射灵敏性。同样，miR-29c、miR-125a-5p和miR-1分别增强食管鳞癌细胞对5-氟尿嘧啶、顺铂和吉非替尼等抗癌药物的灵敏性[33]。Chen等[31]研究发现，linc-VLDLR由外泌体转运时，通过上调靶细胞中ATP结合盒G2(ABCG2)，导致食管鳞癌细胞中的阿霉素耐药。这些结果表明，lncRNAs可增加或减少化学抗性或放射抗性，并且外泌体介导的lncRNAs可能在食管鳞癌中传递化学抗性。此外，LINC00473、lncRNA FAM201A和LINC00657通过调节miRNAs来削弱放疗的效果。因此，对lncRNA研究为食管鳞癌的临床治疗提供了基础。

4.2 胃癌胃液因其直接从细胞分泌而未被肝脏清除，可能成为胃癌的良好生物标志物来源。据报道[32]，胃癌患者胃液样品中的致癌miRNA(miR-421、miR-21和miR-106a)和抑癌miRNA(miR-129和miR-133a)的表达水平较无胃癌患者发生变化，这些胃液miRNA是检测胃癌的潜在生物标记。

还有研究[32]表明，胃癌患者血清miR-21水平升高，阳性预测率为88%，而CA19-9和CEA的阳性预测率分别为50%和46%。循环血浆miR-196a显示出比miR-196b或miR-196a/b组合更高的诊断能力，强调其作为潜在有用的胃癌生物标志物的能力。同样，发现6种血清miRNAs(miR-10b-5p、miR-132-3p、miR-1855p、miR-195-5p、miR-20a-3p和miR-296-5p)在胃癌患者中表达上调，6种miRNAs的AUC为0.702[32]。

ctRNA在胃癌中也具有预后价值。Shimura等[33]研究显示，3种特异性miRNAs(miR-30a-5p、miR-659-3p和miR-3917)在腹膜转移的胃癌患者中过度表达，并加以区分是否腹膜转移患者的AUC值为0.82，且这些miRNA高表达还与预后不良相关。

circRNA通过与miRNA的相互作用调节基因表达。改变的circRNA与肿瘤发生有关，包括胃癌。改变的circRNA-miRNA-mRNA相互作用也与胃癌有关。已经在胃癌组织中报道了各种上调或下调的circRNA。由于它们的丰度、稳定性、组织特异性表达及在不同体液和外泌体中的广泛循环，circRNA可能成为新的诊断生物标志物和胃癌治疗靶点[32]。例如，血浆hsa_circ_0000520水平显示出比组织更好的诊断准确性。血浆hsa_circ_0000520的AUC、灵敏性和特异性分别为0.897、82%和84%，高于组织水平(分别为0.613、54%和86%)[32]。尽管circRNA可被视为潜在的胃癌生物标志物，但它们的有用性需要使用大型队列进一步验证。

4.3 CRC新的证据证实了ctRNA在CRC诊断和预后中的潜力。Yamada等[34]研究显示，CRC患者血清miR-21、miR-29a和miR-125b的水平显著升高，区分早期CRC患者血清miR-21、miR-29a、miR-125b和三者结合的AUC值分别为0.706、0.741、0.806和0.827。还有研究[35]显示，早期CRC患者中miR-506和miR-4316的表达升高，miR-506和miR-4316可将CRC与健康对照者区分的特异性和灵敏性分别为76.8%和60.7%、76.8%和75.0%，可作为早期CRC诊断的潜在血浆标志物。

此外，CRC-LM患者血清miR-203上调，血清miR-203水平较高CRC患者的整体生存率相对较短，血清高水平miR-203与不良生存和转移相关，表明其是CRC患者有潜力的非侵入性预后和转移预测生物标志物[35]。此外，CRC患者血浆miR-199a-5p的增加与较长RFS有关。低水平血清miR-497和miR-30a-5p在CRC患者中是早期诊断和预后监测的有前途的生物标志物。血清tRF/miR-1280在CRC患者中表达较低，可抑制CRC的生长和转移，这为进一步证实tRF/miR-1280作为生物标志物的潜在价值提供证据[35]。

4.4 胰腺癌研究[36]表明，PDAC患者血清miR-133a水平降低和lncRNA ABHD11-AS1水平升高，用于PDAC早期诊断的AUC分别为0.893和0.947。同样，血清miR-21和miR-34a在PDAC组和健康组之间存在差异表达，miR-21和miR-34a的AUC分别为0.889和0.865[36]。此外，低表达的miR-373和高表达的miR-629被认为是PDAC患者早期诊断和预后预测的有前途的生物标志物[36]。

研究表明，PDAC患者circ-LDLRAD3的上调有助于疾病的早期诊断，circ-LDLRAD3的高表达与静脉浸润、淋巴浸润和转移显著相关。如果与CA19-9结合，AUC可达0.87[36]。高水平的血浆miR-221-3p与远处转移和TNM分期密切相关。miR-221-3p远处转移的诊断功效优于CA19-9(AUC：0.689vs0.587)[36]。高血清miR-196a水平PDAC患者生存率较差，miR-210低表达PDAC患者生存率较好。

4.5 HCC许多circ-miRNAs在HCC中显示了预后价值。低水平的miR-1、miR-122、miR-26a、miR-29a和miR-223-3p与较低的生存率相关。miR-155、miR-96和miR-193-5p水平高的患者生存率较低[5]。一项研究报道116例HCC患者全基因组图谱显示[37]，慢性乙型肝炎(CHB)、肝硬化和HCC患者中5个上调miRNA(miR-122-5p、miR-125b-5p、miR-885-5p、miR-100-5p和miR-148a-3p)是CHB感染的潜在生物标志物，而miR-34a-5p可能是肝硬化的生物标志物。值得注意的是，4个miRNA(miR-1972、miR-193a-5p、miR-214-3p和miR-365a-3p)可将HCC与其他非HCC个体区分开。

与miRNAs不同，循环中mRNAs非常不稳定，很少作为液体活检分析物进行研究。目前有两项研究检测了循环中编码AFP的mRNAs浓度[5]。第一组包括38例接受部分切除HCC患者，显示AFP mRNA的检测与肝外复发和更短的DFS相关。第二组在204例(59.5%)和48例(14.0%)HCC患者中检测到AFP和hTERT mRNA。AFP mRNA表达与肿瘤数量相关，但hTERT表达与临床特征之间无关，但未能确定生存率与AFP或hTERT mRNA表达之间的预后影响。

5 结论

液体活检具有微创、经济、省时等优点，作为一种有价值的组织活检替代方法逐渐引起研究者的重视。液体活检作为一种基于个体特征的无创性肿瘤检测策略，在个性化医疗中发挥着重要作用。利用ddPCR、NGS和蛋白质组学等先进技术分析液体活检的生物标志物。此外，各种新技术也在开发中，以利用从血液样本中获得的信息的复杂性。然而，液体活检在临床实践中的应用受到一些挑战的阻碍，只有解决这些问题，液体活检在临床中的作用才能牢固确立。首先，缺乏基础与临床研究标准化是其发展受限的主要原因，如样品类型收集与储存条件、候选分子筛选与和适宜的检测技术等。随着生物标志物检测技术的不断发展，基于芯片的自动检测设备能够在较短时间和高成本纯化步骤的情况下对全血中标志物进行分析，这可能有助于解决这一问题。其次，循环中肿瘤生物标志物的含量较低，且受到其他细胞的干扰，对检测策略的灵敏性和特异性提出了更高要求，而现有的检测方法大多存在不足。此外，检测生物标志物的特殊设备阻碍了液体活检从实验室到临床的广泛应用。如何简化测试过程，降低测试成本是今后需要考虑的问题。近年来的研究表明，液体活检在消化道肿瘤的早期诊断、治疗监测和预后预测等方面具有重要的应用价值，其临床应用潜力巨大。