NLRP3炎症小体在缺血再灌注损伤中的作用研究进展

唐天豪，张莹

【提要】 缺血再灌注损伤是指器官在手术或外伤中遭受缺血打击，血流恢复再通后进一步加重器官损伤。炎症反应是引起缺血再灌注主要损伤之一，特别是NLRP3炎症小体引起的炎症级联反应，主导各器官缺血再灌注炎症损伤。近几年研究表明可通过抑制炎症小体改善缺血再灌注损伤。本文对NLRP3炎症小体在重要器官缺血再灌注损伤中的作用研究进行综述。

缺血再灌注损伤（ischemia reperdusion injury，IRI）是指器官遭受一定时间的缺血缺氧，血流重新灌注后，进一步加重器官结构和功能损伤的现象，它是部分患者在围手术期间发生并发症的重要原因［1］。最近研究发现，IRI中炎症反应起着决定性作用，可通过抑制炎症反应减轻IRI程度［2－3］。现有报道显示，NLRP3炎症小体在各器官IRI的病理生理发展中起着重要作用，是介导炎症反应的主要成分。因此，本文就NLRP3炎症小体在肝、肾、心肌、脑等重要器官缺血再灌注损伤中的作用进行综述。

1 NLRP3炎症小体的结构

炎症小体是一组能够激活主要炎症反应的蛋白复合体，它能够在病原体相关分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）或者损伤相关分子模式（damage-associated molecular patterns，DAMPs）的作用下激活炎症级联反应［4］。根据传感蛋白的结构特点，炎症小体主要有核苷酸结合域样受体（nucleotide-binding domain-like receptors，NLRs），其中包含的成员主要有NLRP1、NLRP3、以及NLRP4等，以及黑色素瘤2样受体（absent in melanoma 2-like receptors，ALRs），如黑色素瘤2（absent in melanoma 2，AIM2）［5］。目前由NLRP3蛋白为核心构建搭造的炎症小体是各界研究的重心。

NLRP3炎症小体是由NLRP3、凋亡相关微粒蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD，ASC）以及胱天蛋白酶-1前体（pro-caspase-1）组成的复合体［6］，这三种蛋白之间的相互作用能灵活调节炎症小体的结构功能，以保证炎症小体在适当的场合才能被激活。NLRP3依据其蛋白结构及功能可划分为三个主要的结构域：pyrin结构域（pyrin domian，PYD）、可调节NLRP3活性的NACHT结构域及富含亮氨酸重复序列的LRR结构域［7］。位于N端的PYD可与其他蛋白的PYD结合并调节下游蛋白，如与ASC蛋白的PYD可形成NLRP3-ASC复合体［8］；NACHT结构域可与三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）结合，将其水解并释放能量调控NLRP3下游蛋白［9］；LRR结构域富含亮氨酸重复序列，具有参与调控NLRP3活性的作用［7］。

2 NLRP3炎症小体的激活途径

NLRP3作为NLRP3炎症小体的的核心成分，是NLRP3炎症小体促进炎症反应中关键调控蛋白，静息时组织细胞内的NLRP3蛋白含量很低，且多数是泛素化无活性的稳定状态，当NLRP3剧增后才能有效激活炎症小体［10］。由于NLRP3炎性小体能够激活炎症级联反应，因此需要对其进行严格的调控，其步骤大致分为以下二步［11－12］：第一步，启动步骤。启动步骤的主要目的是上调NLRP3和白细胞介素-1β前体（pro-interleukin-1β，pro-IL-1β）的表达以及诱导NLRP3翻译后修饰，主要由PAMPs和DAMPs两种不同的模式诱导核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）激活，随后上调NLRP3和pro-IL-1β的表达［13－14］。第二步，激活步骤。多种上游信号通过激活NLRP3诱导炎症小体的形成，已被证实的上游信号主要有离子通道的异常开放（如K＋外流、Ca2＋超载、Cl－外流以及Na＋内流）［15］、受损线粒体释放的线粒体活性氧（mitochondrial reactive oxygen species，mtROS）以及线粒体脱氧核糖核酸（mitochondrial deoxyribo nucleic acid，mtDNA）［16－17］等。遭受各种刺激后，NLRP3通过同型NACHT结构域之间相互作用寡聚，寡聚后的NLRP3再通过同型PYD-PYD之间的相互作用招募ASC，由多个ASC相互汇聚形成ASC斑点，组装好的ASC再通过CARD-CARD的相互作用招募procaspase-1［7，18－19］，形成完整的NLRP3炎症小体。炎症小体通过剪切活化caspase-1，然后再切割pro-IL-1β、pro-IL-18成有活性的促炎因子IL-1β、IL-18，从细胞中释放出来，介导组织炎症反应并加重组织缺血再灌注损伤［20－22］。

3 NLRP3炎症小体在肝脏缺血再灌注损伤中的作用

肝脏缺血再灌注损伤（hepatic ischemia reperdusion injury，HIRI）是肝脏手术中导致肝功能障碍和严重并发症的主要原因，HIRI的一个突出的特点就是发生过度的炎症反应，导致炎症因子及趋化因子的释放，招募循环中的嗜中性粒细胞黏附聚集在肝脏间隙中，释放大量蛋白酶降解细胞，导致肝脏组织受到剧烈的损伤，破坏正常的组织结构［23］。

Vargas等人［24］研究表明，小鼠HIRI模型通过给予甲状腺激素（thyroid hormone，T3）预处理后发现T3能够通过上调腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK），抑制NLRP3炎症小体的激活和IL-1β的分泌以减轻HIRI，使用AMPK抑制剂化合物C（AMPK inhibitor compound C，CC）可逆转这种保护现象。通过实验结果分析，假手术组小鼠表现正常的肝组织病理形态和血清低AST水平，在没有给予T3预处理的情况下，HIRI引起肝结构破坏、肝细胞坏死、中性粒细胞浸润以及NLRP3和IL-1β的mRNA及蛋白的表达升高，上调血清AST水平；使用T3处理组可明显抑制NLRP3及IL-1β的表达水平，降低血清AST；而使用T3＋CC处理后不仅逆转这种现象，还进一步加重肝损伤，上调血清AST水平。从病理组织学和血清AST水平来看，T3体内给药可抑制NLRP3和IL-1β表达水平，减轻肝损伤保护肝功能。Toll样受体4（Toll-like receptors 4，TLR4）激活NLRP3炎症小体的信号通路在HIRI病理生理中至关重要，El-Sisi等［25］人探讨奥曲肽（octreotide，OCT）和褪黑素（melatonin，MLT）在HIRI中可以通过抑制TLR4／NF-κB／NLRP3信号通路减轻肝脏损伤，研究发现肝脏在发生IRI后血清ALT和AST会急剧上升，肝脏组织出现了严重的凝固性坏死、崩解以及出血进入肝索，组织结构失去正常形态，TLR4和NF-κB蛋白表达增强，同时NLRP3、ASC和caspase-1三者mRNA和蛋白表达上调。单独使用75μg／kg剂量的OCT处理可敲低TLR4、NF-κB以及NLRP3炎症小体的表达，显著降低小鼠血清ALT和AST水平，大大减轻了HIRI。Inoue等［26］人试验发现HIRI后NLRP3的mRNA表达升高，表明NLRP3炎症小体在HIRI中起着一定的作用。通过缺失NLRP3蛋白后发现肝脏组织受损面积缩小、血清ALT水平下降，并降低IL-1β、IL-6及CC趋化因子配体2（CC chemokine ligand 2，CCL2）等炎症因子的分泌；免疫组化分析发现NLRP3缺失效应使损伤区域中氧化物质的表达和细胞凋亡数量降低；NLRP3缺失作用还能导致噬中性粒细胞迁移活性受损，使用流式细胞术检测发现肝脏组织中的噬中性粒细胞浸润被显著抑制，减轻炎症反应带来的损伤。ASC对于炎症小体在HIRI中促进炎症反应有着一定影响，Kamo等［27］人的研究中谈及ASC／caspase-1／IL-1β这一信号通路可以通过触发高迁移率族蛋白1（high mobility group protein 1，HMGB1）在HIRI中诱导炎症反应。ASC蛋白缺失抑制了caspase-1／IL-1β信号传导，并减轻HIRI损伤，使抗凋亡功能的局部增强，以及下调了HMGB1介导的和TLR4驱动的炎症反应。用重组HMGB1治疗ASC缺失的小鼠可加重炎症反应。Huang等［28］人实验显示，NLRP3炎症小体可被内源性组蛋白激活，通过激活caspase-1和增加促炎细胞因子IL-1β和IL-18的产生促进HIRI，并且NLRP3蛋白及caspase-1蛋白缺失可减轻HIRI。Zhong等［29］人发现干扰素基因刺激物（stimulator of interferon genes，STING）可通过STING／NLRP3轴促进HIRI和炎症反应，抑制或敲除STING可减少HIRI中炎症因子和趋化因子的分泌。

4 NLRP3炎症小体在肾脏缺血再灌注损伤中的作用

肾脏缺血再灌注损伤（kidney ischemia reperdusion injury，KIRI）在临床中常引起缺血性的急性肾损伤（acute kidney injury，AKI），导致肾脏细胞死亡、凋亡，损伤肾脏组织功能，最后进展为慢性肾病。近几年研究报道，炎症小体相关基因在KIRI中显著表达，激活促炎因子介导主要炎症反应［30－31］。

硫氧还蛋白互作蛋白（thioredoxin-interacting protein，TXNIP）是一种硫氧还蛋白抗氧化剂内源性抑制剂，能够与活化氧相互作用刺激炎症反应，Wen等［32］人的试验研究证实NLRP3炎症小体可以被mtROS／TXNIP／NLRP3信号通路激活以促使缺血再灌注后AKI。在小鼠KIRI模型中测得NLRP3、ASC蛋白表达和共定位增加，同时IL-1β、IL-18、caspase-1的成熟和分泌水平上调，免疫染色显示NLRP3在IRI后的肾小管上皮细胞中高表达，并测得血清肌酐、血尿素氮和尿蛋白排泄率明显上升，且肾小管上皮细胞坏死、刷状缘脱落、管腔形成以及肾小管扩张。实验证实NLRP3炎症小体的激活是由于KIRI所致，并且NLRP3缺失会减轻KIRI诱导的肾脏损伤和炎症小体激活水平，使用线粒体靶向抗氧化剂可通过抑制受损线粒体释放mtROS激活NLRP3炎症小体，减轻肾脏损伤并促进肾功能恢复。Nazir等［30］人研究表明细胞保护性活化蛋白C（cytoprotection by activated protein C，aPC）可通过抑制NLRP3炎症小体的活性减轻KIRI。在小鼠肾脏发生缺血再灌注24 h后，炎症小体被显著激活，NLRP3、pro-caspase-1以及pro-IL-1β蛋白表达明显升高，进一步增加IL-1β、IL-18以及caspase-1的成熟和分泌，同时血清肌酐、血尿素氮和肾脏损伤分子-1浓度升高，肾小管受到严重损伤。使用aPC处理的小鼠肾脏中NLRP3蛋白表达以及IL-1β、IL-18、caspase-1成熟和分泌显著降低，逆转肾脏炎症损伤。Han等［33］人研究表明P2X4受体（P2X4 receptor，P2X4）在KIRI后能促进肾小管炎症小体活化并加剧缺血性AKI。实验中小鼠肾脏经过30 min的缺血再灌注后P2X4野生组可测得NLRP3、IL-1β、IL-18蛋白和mRNA表达明显升高，血浆中的血尿素氮、肌酐以及肾脏中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白mRNA表达水平明显上调，且出现严重肾小管坏死和蛋白管型，肾小管充血扩张、细胞凋亡数增多，而P2X4缺陷组发生IRI后NLRP3炎症小体相关蛋白表达与未发生IRI结局相似，不仅能够抑制IL-1β和IL-18的成熟和分泌，还逆转KIRI所致的缺血性AKI，后续试验在P2X4缺陷组中加用P2X4激动剂，并未能上调NLRP3炎症小体的表达。

5 NLRP3炎症小体在心肌缺血再灌注损伤中的作用

心脏疾病是影响我们人类身体心理健康的主要问题原因之一，特别是由冠心病引起的急性心肌梗死，占据人类病死率首要地位。当心脏发生急性心肌梗死后，最重要的治疗措施便是溶栓或介入治疗，治疗同时常伴随心肌缺血再灌注损伤（myocardial ischemia reperdusion injury，MIRI）［34］，MIRI常诱发无菌性的炎症反应，导致局部组织细胞释放相关分子模式因子激活炎症小体，放大炎症反应、增加细胞死亡数量。

上述aPC还能在MIRI中保护心功能，Nazir等［30］人在小鼠MIRI中测得NLRP3、caspase-1以及IL-1β的蛋白表达上升，心肌梗死面积增加，且炎症小体激活在先而心肌细胞凋亡在后。给予aPC治疗的小鼠不仅减少了炎症小体及促炎因子的表达，还缩小了心肌梗死面积，进一步改善心功能。Yue等［35］研究发现MIRI中NLRP3炎症小体激活可增加小鼠心肌梗死面积和加重心肌功能损伤，钙蛋白酶能够进一步加强这一效应，通过抑制或敲除钙蛋白酶能够降低NLRP3炎症小体的激活，减轻心肌损伤、改善心脏功能。NLRP3炎症小体激活可抑制自噬加重MIRI，meng等［36］人研究表明，MIRI大鼠心脏组织NLRP3的表达量高于正常野生型大鼠；与正常野生型大鼠相比，NLRP3缺失模型无论是否发生了IRI，NLRP3的表达量都处于低水平。除此之外，NLRP3缺失能缩减MIRI的心肌梗死面积；NLRP3缺失作用还能抑制MIRI血清心肌酶（AST、LDH和CK）的上调水平；缺失作用能够显著抑制炎症因子TNF-α和IL-1β表达水平，并且细胞凋亡数量更是被极大地抑制、减少；缺失作用还显著上调自噬蛋白（Beclin1，Atg7，LC3II／LC3I）并降低抗自噬蛋白（p62）的表达。NLRP3炎症小体确实在MIRI诱导的心肌损伤中发挥着重要的作用，NLRP3缺失可以通过激活自噬更进一步改善这种损伤。Liu等［37］人研究表明，在小鼠MIRI中，缺血心脏表现为炎症小体活性增强，NLRP3蛋白表达和caspase-1活性增加，促炎因子IL-1β和IL-18分泌增多。使用炎症小体抑制剂可减轻炎症损伤，减少心肌梗死面积的大小和细胞凋亡的数量。此研究进一步证实ROS可以通过TXNIP／NLRP3通过激活炎症小体，使用ROS清除剂能使TXNIP与NLRP3解离，抑制心脏微血管内皮细胞中NLRP3炎性小体的激活，减轻MIRI炎症反应。

6 NLRP3炎症小体在脑缺血再灌注损伤中的作用

脑血管系统疾病一直是威胁人类生命健康安全严峻的问题，先前许多团队研究表明，炎症小体表达与多种大脑疾病相关，包括阿尔茨海默病、帕金森病及中风等疾病［38－40］。近来越来越多的研究证明NLRP3炎症小体还与脑缺血再灌注损伤（cerebral ischemia reperfusion injury，CIRI）有着密不可分的关系。

粉防己碱（tetrandrine，Tet）可通过沉默信息调节因子1（silent information regulator 1，Sirt-1）／NLRP3信号通路减轻CIRI，wang等［41］人的实验表明小鼠发生CIRI后，组织中NLRP3、caspase-1、IL-1β以及IL-18表达升高，大脑梗死面积增加，且脑积水较假手术增多，使用Tet预处理逆转了这种损伤现象，不仅降低了NLRP3炎症小体的表达，还减少了大脑梗死面积，上调了Sirt-1表达，证明Tet可通过上调Sirt-1表达抑制NLRP3炎症小体的激活减轻CIRI，使用Sirt-1抑制剂能够逆转Tet的这种保护作用，并上调NLRP3炎症小体相关蛋白表达加重大脑梗死面积，如果同时使用Tet和Sirt-1抑制剂处理发现与单独使用Sirt-1抑制剂结局相差无几。Peng等［42］人先通过体外实验证明，BV2细胞在氧-葡萄糖剥夺／复氧（OGD／R）后，ROS／NLRP3炎症小体信号通路被激活导致mtROS生成增加，细胞中NLRP3、caspase-1、IL-1β、IL-18表达升高，使用线粒体靶向抗氧化剂处理后，细胞内ROS明显降低，进一步证实了OGD／R诱导ROS生成主要是由于线粒体功能障碍引起的，抗氧化剂处理后的BV2细胞中NLRP3炎症小体相关表达降低，结果表明mtROS对于NLRP3炎症小体的激活至关重要，艾地苯醌能够抑制mtROS／NLRP3炎症小体这一信号通路，同时mtROS还可以促进mtDNA的氧化，有助于NLRP3炎症小体进一步激活，并显着增加BV2和PC12细胞的炎症；随后在动物实验中证实，大鼠脑在发生IRI后，缺血区域的小胶质细胞中NLRP3和caspase-1表达显著增强，而艾地苯醌抑制了CIRI诱导的NLRP3和caspase-1上调，并减少大脑梗死面积和改善神经功能。该实验进一步证明抑制NLRP3炎症小体激活能够保护IRI带来的神经损伤。近期研究表明，自噬可调节NLRP3炎症小体的激活，Wang等［43］人研究表明，大鼠脑发生IRI后，糖原合酶激酶3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）活性增加并抑制自噬活性，LC3B-II／LC3B-I比率降低而p62相对升高，其NLRP3炎症小体及活化的caspase-1、IL-1β、IL-18的表达水平显著增加，同时大脑梗死面积增加，神经功能受到严重损伤；抑制GSK-3β的活性可增加LC3B-II／LC3B-I比率并降低p62的表达以增强自噬活性，同时抑制NLRP3炎症小体激活，降低caspase-1、IL-1β、IL-18的表达，使用自噬抑制剂（3-MA）可逆转这种现象，更加说明增强自噬可抑制NLRP3炎症小体激活可改善神经功能、减轻CIRI。Ma等人［44］实验表明，当大鼠脑发生IRI后，NLRP3、ASC、caspase-1以及IL-1β蛋白表达增加，大脑缺血区域血液动力学发生了改变，同时大脑梗死面积、血脑屏障通透性以及脑积水显著增加，细胞凋亡数增加、神经功能减退，而用清开灵处理后可降低上述炎症小体及促炎因子的蛋白表达水平，减轻MIRI并抑制炎症反应。

7 总结与展望

NLRP3炎症小体是NLRs家族中研究最多最广泛的炎症小体，它能够在肝、肾、心、脑IRI中介导炎症反应、加重器官损伤、延长器官功能恢复时间，抑制或敲除NLRP3后能够减轻器官相应的炎症反应损伤，促进器官组织结构和功能恢复，肯定了NLRP3炎症小体在IRI中的关键作用。然而，NLRP3炎症小体在IRI中的病理生理机制尚不清楚，仍需要我们今后更多的研究去探讨这一机制。同时，NLRP3炎症小体独特的影响作用不只是在IRI中发挥，还可以通过在其他疾病的发生发展中介导其特殊的炎症损伤反应。因此，NLRP3炎症小体今后的研究将成为国内乃至国外关注的焦点。