应用液相色谱-串联质谱测定慈竹笋壳提取物成分及其抑菌活性1)

唐昊 马洪霜 王昌吉 王明珺 甘晓凤 孙灿 罗朝兵

(乐山师范学院，乐山，614000)

慈竹(Bambusaemeiensis)属于禾本科慈竹属，广泛分布于四川、贵州、湖南等低丘、平原地区，是我国西南地区具有较高经济价值的竹种[1]。慈竹笋为慈竹的嫩芽部分，有着极高的食用、药理价值，是夏季最受欢迎的时令笋之一。其鲜笋颜色洁白，口感清脆，可当作鲜菜或制成笋干、罐头等多种食品[2]。然而，竹笋被加工成各种食用产品时会产生大量的竹笋废弃物，对其处理不当将会造成较为严重的环境污染，给生活带来不利影响。目前，我国虽然有着丰富的竹笋资源，但其总体利用率较低[3]。因此，如何高效地开发、利用竹笋废弃物是当今竹产业中研究热点之一[4]。

竹笋笋壳紧密地包裹着竹笋，随着竹笋发育逐层掉落(图1)。笋壳作为竹笋产业主要废弃物之一，其应用主要是将笋壳制成纺织纤维、动物饲料、液体燃料及工业原料，对其的研究主要是针对笋壳内的活性酶[5]。杨乐等[6]利用树脂法提取纯化竹笋壳中的黄酮物质。谢涛等[7]研究了竹笋壳中木质素、纤维素、半纤维素的组合分离技术。Katsuzaki et al.[8]从竹笋壳中分离并鉴定出紫杉叶素(Taxifolin)、苜蓿素(Tricin)2种抗氧化物质。现有研究发现，笋壳提取物具有抑菌活性。Park et al.[9]采用不同溶剂提取了毛竹、紫竹竹笋中的活性物质，并测定了其抑菌作用、抗氧化能力及对血管紧张素转化酶的抑制效果。高雪娟等[3]通过超声波辅助-有机溶剂提取法获取毛竹笋壳的活性物质，并探究其抑菌效果。Tanaka et al.[10]确定了竹笋皮中的甲醇提取物具有抑菌活性，分离出的活性成分鉴定为豆甾醇(Stigmasterol)、二氢菜子甾醇(Dihydrobrassicasterol)。许丽旋等[11]利用相似相溶原理提取毛竹笋壳中黄酮物质并对其进行了抑菌活性测定。

为了更好的挖掘笋壳的价值，实现竹产业效益的最大化，以现有研究为基础，本研究以慈竹笋壳作为试验原料，利用索氏提取法提取慈竹笋壳的活性物质，并通过液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)测定其组分。通过K-B抑菌圈方法测定慈竹笋壳提取物的抑菌活性，同时探究其稳定性是否受温度、作用时间的影响。本研究为竹笋壳的高效利用及今后新型生物杀菌剂的研发提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验样品及供试菌种

2019年6月于四川省乐山市中区竹林(103°77′E，29°57′N)采集慈竹笋壳。置于阴凉环境通风，烘箱60 ℃烘干至恒质量，研磨成粉，过40目筛[3]后封存待用。

供试菌种为大肠杆菌(Escherichiacoli)、桔青霉菌(Penicilliumcitrinum)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)、粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)、海绵胶煤炱菌(Scoriasspongiosa)，以上菌种均由竹类病虫防控与资源开发四川省重点实验室提供。

1.2 慈竹笋壳提取物的制备

参照洪宏等[12]的方法制备慈竹笋壳提取物。将抽提预处理1 d的定性滤纸及棉线取出，称取5～10 g的慈竹笋壳粉末放入半径为2.5 cm，高为10 cm左右的圆柱形滤纸包(最上端不超过虹吸管上端)，放入提取瓶内。添加120 mL的100%乙醇(2次虹吸的量)进行抽提，直至提取瓶中液体为无色或透明时停止抽提。用旋转蒸发仪将收集瓶中绿色液体进行蒸发浓缩后得到1种膏状物，装存于瓶中，置冰箱4 ℃备用。

1.3 菌种活化及菌悬液制备

本试验采用马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)、Luria-Bertani培养基(LB)分别作为真菌、细菌的培养基，相关配制比例参照沈萍等[13]的方法。于冰箱4 ℃拿出供试菌种后，放入无菌操作台中解冻。待菌种恢复到室温状态，划线接种到相应培养基。细菌于37 ℃培养1 d，真菌于28 ℃培养2 d。挑选单菌落并转接种到新鲜的培养基中培养，转接2～3代，以充分活化菌株[14]。试验前将菌种充分活化后，取6支无菌试管，4支试管中倒入LB培养基、2支试管中倒入PDA培养基(不超过试管的1/5)，制成斜面培养基。将4种细菌、2种真菌菌种分别通过接种环接种于LB、PDA斜面培养基，按上述条件进行培养。待培养完成，于无菌环境用接种环刮取供试菌种至无菌的2 mL离心管内，加入无菌蒸馏水，选择血细胞计数板法，得到浓度为5×106～5×107个/mL的菌悬液[14]，放置备用。

1.4 抑菌活性试验

待培养基稍凉(未凝固)后进行倒平板操作，每个平板约20 mL。放置一旁等待20～30 min。使用200 μL移液枪吸出0.2 mL菌悬液，移至相应培养皿中，迅速进行涂布操作，得到指示含菌平板[3]。各个菌株设置5次重复试验，选择未接种菌悬液的平板作为空白对照。

加无菌蒸馏水将慈竹笋壳提取物配成120 g·L-1的溶液用于试验，采用K-B抑菌圈法研究抗菌活性。将滤纸借助打孔器制成6 mm小圆片，灭菌干燥，浸泡在足量(淹没所有滤纸片)样品溶液中处理1 h后取出，分别轻放于含菌平板中[15]，每个平板内呈三角形放置3片，选择无菌水处理滤纸片用于空白对照。真菌滤纸片28 ℃培养2 d，细菌滤纸片37 ℃培养1 d后，观察抑菌圈，并测量抑菌圈(含滤纸片)直径，以抑菌圈直径为指标评价慈竹笋壳提取物抑菌活性大小[3]。每项抑菌试验设置平行重复5次。

1.5 最小抑菌质量浓度(MIC)测定

测定最小抑菌质量浓度参考高雪娟等[3]的方法。采用二倍稀释法，将慈竹笋壳提取物用无菌蒸馏水对倍稀释为质量浓度为140.000、70.000、35.000、17.500、8.750、4.375 g·L-1的溶液，其余步骤均同于抑菌活性试验，每个质量浓度处理均设3次平行重复。将最小抑菌质量浓度(MIC)定为无抑菌圈出现时的质量浓度。

1.6 温度影响试验

用无菌蒸馏水配制120 g·L-1慈竹笋壳提取液备用。取2 mL溶液放入不同的灭菌试管内，经-20、50、100 ℃不同温度条件处理30 min。选取大肠杆菌(革兰氏阴性代表菌)、金黄色葡萄球菌(革兰氏阳性代表菌)作为指示菌，重复抑菌活性试验，比较高温或低温是否会对慈竹笋壳提取物抑菌活性产生影响。每个处理重复3次。

1.7 浸泡时间影响试验

用无菌蒸馏水配制120 g·L-1慈竹笋壳提取液备用。选择金黄色葡萄球菌、大肠杆菌为试验菌，将灭菌的6 mm圆形滤纸片浸透于一定量的样品溶液中分别处理0.5、3.0、5.0 h后，重复抑菌试验，比较不同处理时间对慈竹笋壳提取物抑菌作用是否产生影响。每个处理重复3次。

1.8 慈竹笋壳提取物成分测定

在样本中加入1 mL 2-氯苯丙氨酸及温度为-20 ℃甲醇，涡旋振荡1 min。涡旋振荡后，离心5 min(转速为12 000 rpm·min-1，温度为25 ℃)，倾出上清液后稀释10倍，过0.22 μm滤膜，进行液相色谱-质谱(LC-MS)检测。然后各取20 μL待测样本混合成校正样本，用来校正混合样品分析结果的偏差以及由于分析仪器自身原因所造成的失误。最后用剩余待测样本进行LC-MS/MS检测。

色谱条件：仪器采用Thermo Ultimate 3000，选用T3色谱柱(2.1 mm×150 mm，1.8 μm)，将自动进样器温度调整为8 ℃，柱温为40 ℃，以0.25 mL·min-1的速度进样2 μL，其中选择正离子：0.1%甲酸水(D)、0.1%甲酸乙腈(C)及负离子：5 mmol·L-1甲酸铵水(B)、乙腈(A)作为流动相进行梯度洗脱，具体程序为0～1 min，V(A)∶V(C)=2%；1～9 min，V(A)∶V(C)=2%～50%；9～12 min，V(A)∶V(C)=50%～98%；12～13.5 min，V(A)∶V(C)=98%；13.5～14 min，V(A)∶V(C)=98%～2%；14～20 min，正模式V(C)=2%(14～17 min，负模式V(A)=2%)。

质谱条件：仪器为Thermo Q Exactive Focus，质谱电离方式为电喷雾电离(ESI)，其中正离子喷雾电压为3.50 kV，负离子喷雾电压为2.50 kV。鞘气流速30 arb，辅助气流速10 arb，毛细管温度为325 ℃，使用70 000的分辨率进行全扫描，范围为81～1 000 m·z-1，高能诱导裂解(HCD)二级裂解，碰撞电压为30 eV，选用动态排除将无关的质谱/质谱(MS/MS)信息去除。

1.9 数据处理

LC-MS所获得的原始数据通过Proteowizard软件(v3.0.8789)转换成mzXML格式，再利用R语言(v3.1.3)的XCMS程序包进行峰识别、峰过滤、峰对齐的操作，最终得到含有峰面积、质核比、保留时间等信息的数据矩阵。试验所有数据的整理、分析均使用Excel 2010及SPSS软件。

2 结果与分析

2.1 慈竹笋壳提取物成分组成

慈竹笋壳提取物共检测鉴定出388种代谢物，按其初级代谢途径共分为8类(表1)。其中与氨基酸代谢相关的代谢物种类最多，有126种，占总鉴定代谢物种类的32.47%，其质量占比为代谢物总质量的16.65%；鉴定到脂质代谢有104种，其质量占比在8大类代谢物中最高，占代谢物总质量的40.69%。

表1 慈竹笋壳提取物参与代谢途径

按照代谢物特性，将这些代谢物分为49类(见表2)，其中有8类至少包含10种代谢物，分别是脂肪酰基类(56种)、羧酸及其衍生物类(47种)、有机氧化合物类(26种)、苯及取代并苯衍生物类(23种)、酚类化合物类(16种)、有机氮化合物类(11种)、黄酮类化合物类(10种)、孕烯醇酮脂类(10种)。

表2 慈竹笋壳提取物分类

续(表2)

我们对鉴定到的慈竹笋壳提取代谢物进行了进一步的分析，其中有20种代谢物的质量占总质量的比例超过了1%(表3)，包括脂肪酰基类1种(9,10-环氧十八烯酸，13.73%)；5’-脱氧核糖核苷类1种(5-硫代甲基酰苷，1.65%)；苯及取代并苯衍生物类2种(间羟基苯甲酸，5.89%、原儿茶酸，1.35%)；酚类化合物类3种(高香草酸，1.88%、对苯二酚，1.47%、3-甲氧酪胺，1.08%)；嘌呤核苷类1种(肌苷，1.01%)；羧酸及其衍生物4种(4-羟基肉桂酸，7.20%、γ-氨基丁酸，3.11%、间香豆酸，1.89%、4-羟基肉桂酰亚胺，1.35%)；有机氮化合物2种(植物鞘氨醇，4.33%、乙酰胆碱，2.11%)；脂肪酰基类2种(13-L-过氧化氢亚油酸，7.06%、9-羰基-反,顺-共轭亚油酸，1.01%)；异喹啉及其衍生物1种(N-甲基乌药碱，5.94%)；3种未知类(赤藓糖醇，7.18%、12-氧植物二烯酸，1.23%、9(S)-羟基-10(E),12(Z),15(Z)-十八碳三烯酸，1.04%)。

表3 慈竹笋壳提取物代谢物成分列表

2.2 慈竹笋壳提取物的抑菌活性

以无水乙醇为提取溶剂，将索式抽提法抽提得到的慈竹笋壳提取物用于真菌、细菌的抑菌试验。测量对照组及试验组抑菌圈大小，用来判断慈竹笋壳提取物是否具有抑菌活性。如表4所示，桔青霉菌、海绵胶煤炱菌抑菌圈的大小在对照组与试验组中均无差异，表明慈竹笋壳提取物对这2种真菌不具备抑制效果。对于供试的大肠杆菌等4种细菌，对照组与试验组抑菌圈的大小存在显著差异，表明慈竹笋壳提取物能抑制这4种细菌生长。同时，本试验通过对比这4种细菌的抑菌圈大小发现，慈竹笋壳提取物对革兰氏阴性菌的抑制效果强于革兰氏阳性菌，如慈竹笋壳提取物对大肠杆菌的抑制效果最好，但慈竹笋壳提取物对大肠杆菌的抑菌效果与对肺炎克雷伯菌相比，无显著优势；但与粪肠球菌、金黄色葡萄球菌相比，有显著差异(P>0.05)。分析可得，慈竹笋壳提取物对真菌无抑制作用，而对细菌具有抑制效果，尤其是革兰氏阴性菌。

表4 慈竹笋壳提取物的抑菌圈直径

2.3 最小抑菌质量浓度测定

为了定量研究慈竹笋壳提取物对常见细菌的抑制活性，本试验测定了慈竹笋壳提取物的抑菌质量浓度，结果见表5。慈竹笋壳提取物可有效抑制大肠杆菌、肺炎克雷伯菌，且抑菌活性随提取液质量浓度的增加而提高，其最小抑菌质量浓度均为4.375 g·L-1；慈竹笋壳提取物对金黄色葡萄球菌、粪肠球菌的抑制效果相对较弱，其最小抑菌质量浓度均为8.750 g·L-1。

表5 慈竹笋壳提取物对供试菌种的最小抑菌质量浓度

2.4 温度对抑菌活性的影响

高温或低温对慈竹笋壳提取物抑菌活性产生的影响见表6。慈竹笋壳提取物经-20 ℃低温处理后，对4种细菌的抑菌活性有显著性差异(P<0.05)；50 ℃高温处理后，对4种细菌的抑菌活性显著上升(P<0.05)；100 ℃高温处理后，对4种细菌的抑菌活性显著下降。温度能够影响慈竹笋壳提取物的抑菌效果，低温处理会导致其对4种细菌的抑菌活性下降，而随着温度升高，抑制活性则上升，持续升高温度后，抑制活性再次降低，但仍有抑菌活性。

表6 温度对慈竹笋壳提取物抑菌作用的影响

2.5 浸泡时间对抑菌活性的影响

浸泡时间对慈竹笋壳提取物抑菌活性产生的影响见表7。随着浸泡时间的增加，慈竹笋壳提取物对大肠杆菌的抑菌效果显著上升(P<0.05)，浸泡5 h后，其抑菌圈直径达到(17.02±0.30)mm。浸泡时间对肺炎克雷伯菌抑菌效果影响较大，但当浸泡时间从3 h增加到5 h，抑菌效果无显著变化(P>0.05)。浸泡时间对金黄色葡萄球菌、粪肠球菌抑菌效果影响较小，浸泡时间从3 h增加到5 h，抑菌效果无显著变化(P>0.05)。由此说明，增加浸泡时间可增强慈竹笋壳提取物的抑菌效果。

表7 浸泡时间对慈竹笋壳提取物抑菌作用的影响

3 结论与讨论

笋壳作为一种竹产业废弃物，其提取物被证明具有抑菌效果[3,11]。本研究探究了慈竹笋壳乙醇提取物对4种细菌，包括2种革兰氏阴性菌(大肠杆菌、肺炎克雷伯菌)、2种革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌、粪肠球菌)，以及2种真菌(桔青霉菌、海绵胶煤炱菌)的抑菌效果。结果表明，慈竹笋壳提取物对真菌无抑制作用，对细菌具有抑制效果，与高雪娟等[3]研究结果一致。

已有研究表明，毛竹笋壳提取物在经过80、100、121 ℃处理后，仍有着很好的抑菌活性，且具有较好的热稳定性[3]。本研究中，慈竹笋壳提取物经过-20 ℃、50 ℃、100 ℃处理后，抑菌活性发生显著变化，但均具有较强活性，表明慈竹笋壳提取物同样具有较好的热稳定性。由于本试验设置的温度跨度较大，仅得出低温或高温对慈竹笋壳提取液的抑菌效果不会产生显著影响。试验数据显示，慈竹笋壳提取物抑菌活性在50～100 ℃间出现了降低趋势，推测在50～100 ℃存在1个抑菌活性拐点。毛竹笋壳提取物对部分细菌的最小抑菌质量浓度为8.750、4.375、35.000 g·L-1[3]，而本研究中，慈竹笋壳提取物对细菌的最小抑菌质量浓度为8.75 g·L-1或4.375 g·L-1，表明慈竹笋壳提取物与毛竹笋壳提取物在抑菌功能方面相似。

本研究运用LC-MS/MS分析了慈竹笋壳提取物成分组成。结果表明，慈竹笋壳提取物中含有大量酚酸类化合物，如苯酚、对苯二酚等，其化学结构中具有1个苯核，是对羟基苯甲酸、羟基苯丙烯酸的衍生物[15]。且有研究证明，酚酸类化合物可以抑制微生物生长、清除自由基等多种生物活性[14]。慈竹笋壳提取物中质量占比最高的是9,10-环氧十八烯酸，有研究表明，9,10-环氧十八烯酸具有较好的抑菌活性[16]。慈竹笋壳提取物中含有丰富的黄酮类化合物，研究表明，黄酮类化合物对细菌中的革兰氏阴性菌、阳性菌均具有较好的抑菌效果[17-18]。慈竹笋壳提取物中含有8种甾体及其衍生物，而植物甾体化合物，如硫脲类化合物是具有抗菌生物活性的天然产物[19]。慈竹笋壳提取物具有丰富的抑菌活性物质，可进一步通过分离提纯的方法深入研究这些活性物质的功能、机制。

本研究通过探究慈竹笋壳提取物的抑菌种类、最小抑菌质量浓度、温度及浸泡时间对抑菌活性的影响，探究了其抑菌潜能，同时通过LC-MS/MS技术分析其活性成分，为慈竹笋壳的综合利用及新型杀菌剂的开发提供了参考。