戴尔有孢圆酵母与酿酒酵母混合发酵对猕猴桃酒香气的影响

尹雪林，龚丽娟，钟 武，李二虎

（华中农业大学食品科学技术学院，湖北 武汉 430070）

猕猴桃，又名奇异果、羊桃等，为猕猴桃科猕猴桃属落叶藤本植物，猕猴桃果实富含VC、多种氨基酸和矿物质等，营养价值和药用价值高，有“VC之王”的美誉[1]。猕猴桃是典型的呼吸跃变型水果，生理后熟过程明显导致其不耐贮藏，皮薄汁多易受到机械损伤和微生物侵染而腐坏，因此将猕猴桃精深加工成高附加值产品能够有效解决猕猴桃腐烂浪费的情况[1-2]。猕猴桃酒作为猕猴桃的一种精深加工产品，其风味独特、营养成分高，但在实际生产过程中，由于猕猴桃的品种差异、发酵菌株的选择、接种方式等原因，猕猴桃酒尚存在香气稀薄、典型性欠佳等缺点[3-4]。为解决猕猴桃酒香气稀薄的问题，有研究者提出利用非酿酒酵母和酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）混合发酵改善猕猴桃酒的香气品质[5]。有研究结果表明，相对于传统的发酵方式，利用非酿酒酵母与酿酒酵母混合发酵对果酒的风味和口感发挥着积极作用[6-7]。Iris等[8]研究发现与纯培养酿酒酵母发酵相比，非酿酒酵母和酿酒酵母混合接种会产生更多的二乙酰、乳酸乙酯和2-苯乙基乙酸酯等；Comitini等[9]研究表明，与单接种酿酒酵母相比，两种酵母混合发酵降低了葡萄酒的挥发性酸度，同时提高了酒中2-苯基乙醇和多糖的含量。

非酿酒酵母是一类自然存在于浆果、果梗表面、果园土壤或酿酒环境中可参与果酒发酵的微生物，在发酵过程中会产生高级醇、酯类、萜类化合物、乙醛、乙酸等代谢产物，这些不同的代谢产物会影响果酒的香气成分、酒体、风味和复杂性，进而影响果酒品质[10-13]。戴尔有孢圆酵母（Torulaspora delbrueckii）是一种非常有发展潜力的非酿酒酵母，具有良好的酿酒特性，能产生低挥发性酸、乙酸乙酯、乙醛、乙偶姻等，对SO2有较高的抗性，能耐受16.5%乙醇，有较好的生物转化萜的能力，以及增加某些芳香族化合物的产量等特性[14]。Azzolini等[15]研究表明戴尔有孢圆酵母和酿酒酵母混合发酵提高了Narince葡萄酒的香气强度和复杂性，缓和了葡萄酒的发酵速率，进一步提高了醇类和酯类的含量。原苗苗等[16]研究发现戴尔有孢圆酵母与酿酒酵母混合发酵可以增强葡萄酒的发酵香气，使酒中乙基酯类物质含量明显增加，提高酒的香气复杂性。戴尔有孢圆酵母在高糖环境中能够产生较低含量的乙酸，可以耐受猕猴桃原汁或者额外添加糖所产生的高糖环境[17-18]。

戴尔有孢圆酵母作为非酿酒酵母，与酿酒酵母混合培养应用于猕猴桃酒的酿造还鲜有报道，因此本实验将戴尔有孢圆酵母和酿酒酵母混合接种于猕猴桃汁中进行发酵，探究混菌发酵对猕猴桃酒香气的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌株与试剂

酿酒酵母RV002、戴尔有孢圆酵母SY-2-2 安琪酵母股份有限公司；猕猴桃 秦品源农业发展有限公司。

果胶酶、L-苹果酸（化学纯）、柠檬酸（99.995%）、DL-酒石酸（≥99.999 5%） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；无水乙醇（≥99.9%）、偏重亚硫酸钾、草酸、磷酸、碳酸氢钠、2,6-二氯靛酚、重铬酸钾、碘化钾、L(+)-抗坏血酸标准品（均为分析纯），3,5-二硝基水杨酸（化学纯） 国药集团化学试剂有限公司；香气物质标准品 美国Sigma公司；白砂糖市售；其他试剂均为分析纯。

1.1.2 培养基

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YEPD）培养基 北京酷来搏科技有限公司；马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基青岛高科技工业园海博生物技术有限公司。

WL（wallerstein laboratory nurtrient agar）培养基：酵母浸粉4 g/L，蛋白胨5 g/L，葡萄糖50 g/L，琼脂20 g/L，储液A 40 mL/L，储液B 1 mL/L，储液C 1 mL/L，121 ℃灭菌20 min。

储液A：1.25 g氯化钙、1.25 g硫酸镁、4.25 g氯化钾、5.5 g磷酸二氢钾，定容至400 mL，121 ℃灭菌20 min后4 ℃保存；使用时按照40 mL/L加入。

储液B：0.25 g氯化铁、0.25 g磷酸锰，定容至100 mL，121 ℃灭菌20 min后置于4 ℃的冰箱中保存；使用时按照1 mL/L加入。

储液C：0.44 g溴钾酚绿溶于10 mL无菌水和10 mL 95%乙醇溶液中；使用时按1 mL/L加入。

1.2 仪器与设备

SPX-250B生化培养箱 天津市泰斯特仪器有限公司；TGL-16g离心机 飞鸽仪器有限公司；UV-1700紫外-可见分光光度计 日本岛津公司；e2695高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）仪美国Waters公司；6890N/5975B气相色谱-质谱联用仪美国Agilent公司；HH-S型恒温水浴锅 上海合恒仪器设备有限公司；LDZX-50KBS立式高压蒸汽灭菌锅上海申安医疗器械厂。

1.3 方法

1.3.1 猕猴桃酒发酵工艺流程

1.3.2 操作要点

原料处理：挑选成熟良好的新鲜猕猴桃，洗净晾干去皮后，放到已灭菌的榨汁机中破碎打浆，称质量，记录。

果浆处理：按60 mg/kg在果浆中加入偏重亚硫酸钾；按150 mg/L的添加量加入果胶酶，40 ℃恒温水浴酶解1.5 h，4 层纱布过滤取得猕猴桃汁。

成分调整：为了方便猕猴桃酒的存放，将目标酒度设为11%（V/V），发酵前在猕猴桃汁中添加适量的白砂糖使其可溶性固形物含量达到20 °Brix以上[19-20]。

灭菌：按300 mL/瓶的量将猕猴桃汁分装，以65 ℃恒温水浴30 min。水浴灭菌后，将发酵瓶置于无菌操作台紫外杀菌，冷却至常温后接菌发酵。

主发酵：酿酒酵母接种量为1%（0.7×106CFU/mL），戴尔有孢圆酵母接种量为2%（1.8×106CFU/mL），按以下4 种方式接种：A为单接种酿酒酵母；B为同时接种戴尔有孢圆酵母和酿酒酵母；C为顺序接种戴尔有孢圆酵母和酿酒酵母：先接种戴尔有孢圆酵母发酵48 h后，再接种酿酒酵母；D为单接种戴尔有孢圆酵母；每种接种方式设置3 个重复。将4 组发酵瓶置于25 ℃恒温培养箱中静置发酵6～8 d，待糖质量浓度降至10 g/L后结束主发酵。

后发酵：将倒罐后的酒样置于18 ℃恒温培养箱中静置发酵10 d左右结束后发酵。将后发酵结束后的酒样通过4 层纱布过滤并沉淀，取上清液贮存于-20 ℃冰箱待用。

1.3.3 菌种活化与保存

取2 株酵母菌冻存液（50%甘油保存）各1 管于YEPD培养基中，于28 ℃、120 r/min条件下培养24 h后，在PDA固体培养基上进行划线分离，并于28 ℃培养2 d。在PDA固体培养基上挑取菌落特征明显的菌株接种于YEPD液体培养基中，于28 ℃、120 r/min条件下培养24 h制成种子液。取已活化的酵母种子液各1 mL于灭菌的冻存管内，再各加入1 mL已灭菌的50%甘油，混匀后置于-20 ℃冰箱内保存。

1.3.4 酵母计数

酿酒酵母用YEPD固体培养基计数，戴尔有孢圆酵母用WL培养基计数。

1.3.5 香气成分的测定

1.3.5.1 香气成分的检测

采用顶空固相微萃取进行香气成分的富集[21]，然后对其进行检测，方法如下：采用6890N型气相色谱仪，色谱柱：HP-5MS弹性石英毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）。升温程序：起始温度40 ℃，保持5 min，后以3 ℃/min的速率升温至120 ℃，再以8 ℃/min的速率升温至230 ℃，保持10 min；分流方式：不分流；载气：He，流速：1.0 mL/min。5975B质谱条件：接口温度250 ℃，离子源温度230 ℃，四极杆温度150 ℃，离子化方式电子电离，电子能量70 eV，质量扫描范围50～550 u。

1.3.5.2 香气成分的定性与定量

定性：通过检测得到的质谱数据与NIST 05质谱库进行对比定性，实验结果保留Qual＞70的鉴定结果。定量：采用内标法进行定量，选用环己酮作为内标物质。计算公式如下：

1.3.6 理化指标的测定

可溶性固形物含量：采用自动阿贝折射仪测定；澄清度：采用分光光度计法测定，即发酵液在分光光度计波长680 nm下的透光率；挥发性酸含量：采用乙酸酶联免疫反应试剂盒方法测定；pH值：采用pH计测定；乙醇体积分数：采用重铬酸钾氧化法测定[22]；总酸含量：采用酸碱滴定法测定；还原糖含量：采用3,5-二硝酸水杨酸法测定[23]；总酚含量：采用Folin-Ciocalte比色法测定[24]；VC含量：采用2,6-二氯靛酚滴定法测定。

1.3.7 猕猴桃酒样香气感官分析

猕猴桃酒评分标准参照李华敏等[25]的方法并稍作修改，评价小组由10 名感官评价人员组成，包括5 男5 女，年龄24～27 岁，猕猴桃酒香气描述词汇为果香、花香、酒香、草本香、甜香和整体香气强度[25-26]，评分选取10点制（0为没气味，9为气味最强）：0～3低强度，3～6中等强度，6～9高强度。

1.4 数据统计与分析

使用SPSS 23.0软件进行统计分析，利用方差分析（analysis of variance，ANOVA）、最小显著性差异法（least significant difference，LSD）进行差异显著性检验和多重比较，P＜0.01，差异极显著；P＜0.05，差异显著。使用Origin 2018软件作图。

2 结果与分析

2.1 猕猴桃汁中酵母活菌数动态变化及理化指标

2.1.1 不同接种方式下活菌数变化

4 组猕猴桃酒在发酵初期，戴尔有孢圆酵母和酿酒酵母均能适应发酵环境并快速增长。图1中，发酵第2天戴尔有孢圆酵母活菌数达到峰值（9×106CFU/mL）后急速减少，说明其生长受到阻碍，4 d后又缓慢增加；发酵第4天酿酒酵母活菌数最大（3×107CFU/mL），之后数量缓慢减少并趋于稳定。图2中，接种酿酒酵母后，戴尔有孢圆酵母的生长受到一定程度的抑制，活菌数下降，第4天活菌数达到最高值（6×107CFU/mL）；酿酒酵母的生长也受到抑制，第6天活菌数达到峰值（3×106CFU/mL）。图3中，单独发酵组的酿酒酵母和戴尔有孢圆酵母表现出较强的发酵动力，第4天活菌数达到峰值，分别为5×107、8×107CFU/mL。结果表明，戴尔有孢圆酵母和酿酒酵母混合发酵前期均能正常生长，后期生长会受到一定程度的抑制，抑制原因可能是由于激烈的营养竞争或是细胞-细胞接触介导机制使活菌死亡。也有研究报道混菌发酵过程中酵母生长受到抑制的现象[27-28]。本实验采用先接种戴尔有孢圆酵母再接种酿酒酵母的顺序接种发酵方式，因为一般非酿酒酵母菌株生长繁殖的速率比酿酒酵母慢，前期预实验结果和其他研究数据表明，先接种戴尔有孢圆酵母48 h后活菌数达到一定的量，对葡萄酒的香气和品质有积极贡献[29-30]。本实验同时接种发酵组的戴尔有孢圆酵母在第4天活菌数开始增多，可能是由于戴尔有孢圆酵母分泌了某些针对酿酒酵母的代谢产物或毒素，导致酿酒酵母的生长受到抑制，戴尔有孢圆酵母开始生长[31]。

图1 同时接种方式下戴尔有孢圆酵母和酿酒酵母活菌数动态变化Fig.1 Dynamic changes in the viable count of T.delbrueckii and S.cerevisiae in simultaneous inoculation

图2 顺序接种方式下戴尔有孢圆酵母和酿酒酵母活菌数动态变化Fig.2 Dynamic changes in the viable count of T.delbrueckii and S.cerevisiae in sequential inoculation

图3 单接种戴尔有孢圆酵母、酿酒酵母的活菌数动态变化Fig.3 Dynamic changes in the viable count of T.delbrueckii and S.cerevisiae in single inoculation

2.1.2 猕猴桃酒的理化指标

猕猴桃酒的理化指标见表1。混菌发酵组与单接种酿酒酵母组相比，乙醇体积分数、总酸含量和pH值差异最显著。总酚质量浓度在0.56～0.76 g/L之间，挥发性酸质量浓度为0.2～0.37 g/L，在各个猕猴桃酒之间存在一定差异。本实验的顺序接种发酵组产乙醇低于单接种酿酒酵母组，这与前人的研究结果一致[32]。有研究发现戴尔有孢圆酵母与酿酒酵母混合发酵会增加果酒的香气复杂性，降低乙酸的产量[33-34]，但本实验却并未发现混菌发酵组的乙酸量显著降低，可能与发酵水果种类有关，也可能与所用戴尔有孢圆酵母菌株有关。

表1 猕猴桃酒理化指标Table 1 Physicochemical indexes of kiwifruit wine

2.2 猕猴桃酒挥发性成分分析

2.2.1 不同接种方式所得猕猴桃酒的挥发性成分

由表2可知，单接种酿酒酵母组测得16 种挥发性成分，总质量浓度为312.18 mg/L；同时接种发酵组测得20 种挥发性成分，总质量浓度为282.17 mg/L；顺序接种发酵组测得23 种挥发性成分，总质量浓度为336.95 mg/L；单接种戴尔有孢圆酵母组测得14 种挥发性成分，总质量浓度为315.81 mg/L。单接种酿酒酵母组和同时接种发酵组的挥发性成分均以酯类为主，含量较多的是癸酸乙酯、辛酸乙酯、十二酸乙酯等，赋予猕猴桃酒浓郁的花果香。顺序接种发酵组和单接种戴尔有孢圆酵母组的挥发性成分以醇类为主，含量较高的是苯乙醇。顺序接种发酵组中萜烯类物质含量最高，特有β-大马士酮、松油烯、香茅醇、2-乙基己醇、苯甲醇、α-松油醇、4-乙烯基愈创木酚、2,4-二叔丁基酚。

表2 猕猴桃酒的各种挥发性成分质量浓度Table 2 Volatile compound concentrations in kiwifruit wine mg/L

酵母种类不同产生的生理活性及代谢过程不同，对香气成分的影响也不同[16]。与单接种发酵组相比，戴尔有孢圆酵母与酿酒酵母混合发酵能够提升猕猴桃酒香气成分的种类和含量，增强猕猴桃酒的香气特征，这与Eollero等[35]的研究结果一致。有研究发现戴尔有孢圆酵母产辛酸乙酯的能力较强[36]，但本实验中辛酸乙酯的含量较低，可能是酿酒酵母抑制了戴尔有孢圆酵母的产酯能力，也有可能是使用的戴尔有孢圆酵母菌株不同。顺序接种发酵组和单接种戴尔有孢圆酵母发酵组中苯乙醇含量较高，可能与戴尔有孢圆酵母中β-葡萄糖苷酶的活性有关，也可能是酵母中β-葡萄糖苷酶的活性与L-苯丙氨酸的代谢共同作用的结果[16]。祝霞等[37]研究发现，戴尔有孢圆酵母和酿酒酵母顺序接种发酵的酒样中萜类、醇类等化合物明显增加，提高了酒体的香气复杂性和层次感，本研究顺序接种发酵组萜烯类化合物的含量最大。Romano等[38]研究表明顺序接种发酵葡萄酒与同时接种发酵葡萄酒在香气成分上有很大差别，前者的香气成分更加复杂。本研究同时接种发酵组和顺序接种发酵组虽然都提高了猕猴桃酒香气物质的含量，但两者也有差异。同时接种发酵组更多地提高了十二酸乙酯、癸酸异戊酯、十四酸乙酯和十六酸乙酯含量，顺序接种发酵组更多地促进了苯乙酸乙酯、乙酸苯乙酯、桉树油醇、芳樟醇、苯乙醇、β-大马士酮、松油烯的生成，而且顺序接种发酵组的香气成分种类和总含量最高。

2.2.2 主要挥发性成分气味活性值（odor activity value，OAV）分析

挥发性物质对酒样香气感官的贡献率通常用OAV表示，当香气质量浓度大于感觉阈值（OAV＞1）时，这种香气可以被人类的嗅觉感知；当香气质量浓度小于感觉阈值（OAV＜1）时，虽不能被人类直接感知，但对酒样整体香气有一定的调节作用。猕猴桃酒OAV分析结果如表3所示。酯是通过醇和酸的酯化反应生成，乙醇发酵过程中产生的酯类物质可赋予果酒独特的花果香[44]。单接种酿酒酵母发酵组和同时接种发酵组OAV较高的是辛酸乙酯、己酸乙酯、癸酸乙酯，这些酯类化合物具有典型的水果香气，如菠萝、梨、椰子等[39]，因而能赋予猕猴桃酒浓郁的果香味。醇类化合物既是芳香物质又是呈味物质，还能衬托酯香，适宜浓度的醇类物质可以增加香气的协调性[45]。顺序接种发酵组OAV大于1的香气成分较多，主要是β-大马士酮、乙酸苯乙酯、芳樟醇、苯乙醇等，这些挥发性物质主要呈现玫瑰、铃兰等花香[39,41]，能赋予猕猴桃酒独特的花香。顺序接种发酵组特有的松油烯、2,4-二叔丁基酚、苯甲醇、芳樟醇、香茅醇等能赋予猕猴桃酒清甜的果香和浓郁的花香。为了更直观地看出各香气OAV的差异，对OAV大于1的香气化合物进行热图统计分析（图4）。与同时接种发酵组相比，顺序接种发酵组不仅含有较多OAV大于1的酯类香气成分，也含有许多能被嗅觉感知到的醇类、酚类、萜烯类化合物，由此推测顺序接种发酵组的猕猴桃酒香气特征更加丰富。由气味活度值结果可推测顺序接种发酵组的花果香味更浓郁，香气层次更丰富，但实际结果要根据感官分析进一步验证。

表3 猕猴桃酒中OAV大于1的芳香化合物及其气味特征Table 3 Mean values of OAV and aroma characteristics of volatile compounds with OAV > 1 in kiwifruit wine

图4 OAV大于1的挥发性香气成分热图Fig.4 Heat map of volatile aroma components with OAV > 1 in kiwifruit wine

2.2.3 OAV叠加香气分析

本实验将具有相似气味描述的挥发性物质的OAV（OAV＞1）叠加，建立芳香系列，用来表明戴尔有孢圆酵母与酿酒酵母混合发酵对猕猴桃酒香气特征的影响以及不同香气成分对猕猴桃酒嗅觉感官的影响。根据已有研究[39-43]，这些挥发性化合物的香气与“菠萝”“柑橘”“玫瑰”“蜂蜜”“草药”“蜡味”和“脂肪酸”相关，最终获得5 种芳香系列的挥发性化合物，包括果香、花香、甜香、草本香、脂肪香。由图5可知，单接种酿酒酵母组的果香系列香气最大；顺序接种发酵组花香、甜香、草本香系列香气最高，一方面是由于产生了较多的苯乙醇、乙酸苯乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯，另一方面，虽然桉树油醇、β-大马士酮、芳樟醇、苯甲醇的质量浓度低，但它们对应的阈值偏低，所以花香、甜香、草本香明显。

图5 OAV叠加香气分析图Fig.5 Superimposed OAVs of aroma components

2.3 猕猴桃酒香气感官分析

由图6可知，单接种酿酒酵母组的果香、酒香最浓郁，花香、甜香味最低，草本香处于中等强度，整体香气评分第2。同时接种发酵组拥有中等强度的果香、花香、酒香、甜香，草本香味最低，整体香气评价中等偏低。顺序接种发酵组的花香、草本香、甜香最浓郁，果香、酒香处于中等水平，整体香气评分最高。单接种戴尔有孢圆酵母发酵组具有中等强度的果香、花香、草本香、甜香，酒香和整体香气评分最低。感官品评结果与本实验的挥发性成分测定结果基本相符，顺序接种发酵组的呈香物质β-大马士酮、乙酸苯乙酯、芳樟醇、苯乙醇等够能赋予猕猴桃酒独特的花香，特有的呈香物质松油烯、2,4-二叔丁基酚、苯甲醇、芳樟醇、香茅醇等能赋予猕猴桃酒清甜的果香和花香。

图6 猕猴桃酒香气品评结果Fig.6 Sensory evaluation of aroma characteristics of kiwifruit wine

3 结 论

为确定酿酒酵母和戴尔有孢圆酵母混合发酵对猕猴桃酒风味的影响，本实验以单接种酿酒酵母、单接种戴尔有孢圆酵母为对照组，同时接种戴尔有孢圆酵母和酿酒酵母、顺序接种戴尔有孢圆酵母和酿酒酵母为实验组进行猕猴桃酒发酵实验。结果表明，混菌发酵组产生的香气成分种类高于单菌发酵组，且顺序接种发酵组的挥发性成分种类（23 种）和总质量浓度（336.95 mg/L）均最大。混菌发酵组与单接种酿酒酵母组相比，顺序接种发酵组的乙醇体积分数、挥发性酸、总酸含量最低。戴尔有孢圆酵母的参与提高了顺序接种发酵组中挥发性物质含量和种类，特别是苯乙酸乙酯、苯丙酸乙酯、苯乙醇、β-大马士酮、α-松油醇、桉树油醇等物质，赋予猕猴桃酒浓郁的花果香味并丰富了猕猴桃酒的香气成分。香气感官分析表明顺序接种发酵组的花香、草本香、甜香味更加浓郁，酒香和果香次之，整体评分最高。综上所述，戴尔有孢圆酵母和酿酒酵母顺序接种发酵产生的猕猴桃酒香气更丰富，对改善猕猴桃酒的香气品质有积极作用。因此，本研究探究戴尔有孢圆酵母与酿酒酵母混合发酵对猕猴桃酒香气品质的影响，为解决猕猴桃酒香气稀薄的问题以及非酿酒酵母在猕猴桃酒的生产应用提供理论依据。