生物可降解丝素蛋白在骨科中的应用与进展

贾明鲲 闫景龙

0 引言

创伤、感染、肿瘤等多种因素可造成骨缺损，严重的骨缺损会引发骨的延迟愈合和不愈合，如果并发感染演变成骨髓炎，则需行截肢手术，导致严重的残疾，给患者带来经济和心理上的负担[1]。骨缺损的治疗一直是骨科医生面临的严峻挑战，传统治疗骨缺损的方法是自体骨和异体骨移植，但自体骨移植来源有限、伴有取材部位的二次损伤；异体骨移植面临着伦理问题、排斥反应、病毒传播等风险[2]。组织工程是解决组织和器官缺损的一种重要手段，它通过建立由细胞和生物材料构成的三维空间复合体并以此来填充缺损，从而达到修复的效果[3]。种子细胞、支架材料、生物活性因子是组织工程中的三要素[4]，支架材料为细胞增殖和黏附提供空间环境，引导细胞生长，是组织工程中的研究热点。合成聚合物和天然聚合物是常用的两大支架材料，丝素蛋白(silk fibroin,SF)作为一种天然聚合物，具有良好的生物相容性，易降解、机械性能优异，SF还具有优异的可塑性，可通过不同生产工艺制备成各种形式，如薄膜、水凝胶、纳米纤维以及多孔海绵[5]。本文简要介绍了SF的组成结构、生物学特性以及SF在骨科中的应用与进展。

1 丝素蛋白的结构和特性

1.1 SF的组成结构

SF是许多节肢动物“纺纱”过程分泌的产物，节肢动物利用丝蛋白来筑巢、结茧、筑网等。丝纤维主要源于柞蚕、蓖麻蚕、家桑蚕和蜘蛛[6]。从组成成分上看，蚕丝主要由丝素蛋白和丝胶蛋白组成，丝素蛋白大约占70%～80%，丝胶蛋白和少量蜡质组成了剩下的20%～30%[7]；SF包括18种氨基酸，其中甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸含量最多，大约占87%。从基本结构上看，SF结构主要由结晶区和非结晶区组成，结晶区的丝素蛋白之间形成稳固的β-折叠，是高韧性和抗拉伸能力的来源；非结晶区肽链之间作用力弱，排列无序且含有较多极性基团，是高延展性和高弹性的来源[8]。从分子构象上看，SF主要包括silk I和silk II两类，silk I由无规卷曲和α-螺旋交替堆叠而成，silk II是反向平行的β-折叠，该结构更加稳定，是SF的基础构象，silk I和sikl II两者可通过湿热、极性溶剂、pH等条件处理进行转变。SF分子链上具有羟基、羧基、胺基等活泼基团，通过化学反应可以引入一些功能基团、单体、大分子链等，开发出具有不同性能的蚕丝，或通过这些基团与多种生物材料结合成复合材料，从而拓宽SF的应用领域[9]。

1.2 SF的生物学和理化特性

作为一种天然聚合物，SF具有以下优点。(1)优异的机械强度。研究[10]发现SF的力学性能与其二级结构相关，其中形成silk II β-折叠结构的肽链排列规整，相邻链段间的氢键数量多、分子间引力稳定，构成了SF材料高生物力学强度的基础。赵亮[11]通过双层蛛丝蛋白制备出了爆破强度达到43～150 kPa的血管支架，满足了人工血管强度应高于18.7 kPa的力学要求，避免了因人体收缩压导致的血管爆破。(2)良好的生物相容性。Chang等[12]将SF支架植入大鼠腹壁，HE染色结果显示，SF植入支架周围和内部均有细胞生长，且支架周围结缔组织生长致密，支架内细胞沿纤维生长良好、排列整齐，SF支架未对大鼠机体产生毒性反应。Zhuang等[13]将制备出的聚氨酯/SF复合膜和人脐静脉内皮细胞进行共培养，通过透射电镜观察发现，内皮细胞在SF复合膜上分布均匀、黏附良好、细胞结构完整、细胞核和细胞质清晰。(3)生物可降解性。研究[14]表明作为一种蛋白质，丝素蛋白可在生理环境下被糜蛋白酶、羧化酶等所分解，且分解后的产物主要为甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸等氨基酸，能够为生物体内所吸收利用。Wang等[15]通过冻干法制备出了SF/海藻酸钠多孔支架，将多孔支架植入大鼠体内21天，通过Masson染色结果发现，SF/海藻酸钠多孔支架被周围组织浸润包裹，多孔支架质量减少并失去结构完整性，表明该SF/海藻酸钠复合支架在动物体内能够发生降解。

2 SF支架在骨组织修复中的应用

2.1 SF水凝胶支架与软骨修复

生理环境下关节软骨缺乏血运，仅靠关节滑液进行营养支持，一旦损伤很难自行修复，临床上治疗关节软骨疾病的方法有软骨移植、关节置换、软骨下穿透术等，虽然这些方法在短期内可缓解症状，但不能确保软骨长期的功能恢复，通过构建SF水凝胶支架修复关节软骨为软骨损伤修复提供了新思路，研究[16]表明SF水凝胶能够为软骨细胞增殖和软骨基质的产生提供微环境，促进软骨细胞的修复再生。Singh等[17]的研究表明，SF水凝胶能够上调软骨形成转录因子sox-9、II型胶原(collagen II,Col II)和聚蛋白多糖(aggrecan)的表达，从而引起软骨细胞外基质的增加，进而促进软骨细胞的增殖。此外其组织学和免疫组化分析的结果也证实，加入SF的水凝胶和软骨细胞共培养后，表达出具有更高的细胞外基质沉积和II型胶原蛋白。Liu 等[18]将硫代壳聚糖(thiolated chitosan，CS-NAC)和SF共混制备出具有双网络结构的水凝胶支架，并将其与软骨细胞共培养。免疫组化染色显示与不含SF的水凝胶支架相比，CS-NAC/SF水凝胶中Col II含量高达60%以上，表明加入SF的水凝胶能够通过维持II型胶原的含量来保留软骨细胞的正常功能和表型。Li等[19]制备出了结合壳聚糖纳米颗粒的SF水凝胶支架，并将其植入兔膝关节软骨缺损模型，II型胶原免疫染色结果显示，植入SF水凝胶支架的膝关节缺损处被透明软骨修复填充，新生细胞团中出现软骨陷窝，表明该SF水凝胶支架能够有效修复软骨缺损。

2.2 SF复合支架与骨缺损修复

大节段骨缺损的治疗一直是骨组织修复的难题，支架植入体内后常因与周围骨组织无法融合导致植入失败，将负载生长因子、骨种子细胞的SF复合支架植入骨缺损部位，促进缺损部位骨组织的分化和增殖以此修复骨缺损，已成为组织工程修复骨缺损的一种重要策略。作为参与组织基质矿化的重要酶，碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)常由成骨细胞分泌起到成骨诱导效应[20]，Burger 等[21]将SF-纤维素支架与MC3T3-E1细胞共培养，发现与不含SF的支架相比其ALP含量更早达到顶峰，表明SF-纤维素支架能够加速MC3T3-E1成骨分化进程，通过进一步的研究发现低分子量SF的加入能够抑制Notch通路，从而上调成骨相关因子ALP的表达。Kundu等[22]将SF支架和人骨髓间充质干细胞(human adipose tissue-derived stem cells，hASCs)共培养，发现hASCs中骨蛋白和骨桥蛋白表达上调，并出现棒状矿化结晶，通过进一步的研究发现SF能够通过替代纤维I型胶原为羟基磷灰石(hydroxyapatite，HAp)提供矿化的成核位点，从而发挥成骨效应。Yang 等[23]研究了聚乙二醇(PEG)/HAp/SF复合支架对大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cell，BMSC)成骨分化的影响，研究发现与纯PEG、纯HAp、纯SF支架相比，复合支架组的成骨相关标志物骨涎蛋白(bone sialoprotein,BSP)、骨钙蛋白(osteocalcin,OCN)、骨保护素(osteprotegerin,OPG)、Runt相关转录因子2(RUNX2)的表达上调了3～4倍。Gandhimathi等[24]通过静电纺丝法制备出了聚己内酯/SF/SiO2纳米纤维支架，研究表明SF的添加不仅能够上调BMSC细胞OCN的表达水平，还能增加支架的孔径使其孔隙率达到92%，有利于新生骨细胞与支架的融合从而促进骨组织修复。

2.3 3D打印支架与骨组织修复

三维生物打印技术是一种基于预编程数字蓝图的3D打印细胞装载结构的技术，它可以构建带有细胞的3D结构，模拟具有复杂结构和功能的组织和器官[25]。SF可用作生物墨水的添加剂，通过3D打印技术，可以构建出更适合骨缺损的内固定支架开展个体化治疗[26]。Hong等[27]以SF和甲基丙烯酸缩水甘油酯(glycidyl methacylate,GMA)为原料合成了生物油墨，并通过数字光处理3D打印制备出了SF-GMA水凝胶。研究人员将其与软骨细胞进行共培养，RT-PCR结果显示Col II、X型胶原表达上调，并在第4周发现作为软骨细胞外基质重要组成成分的糖胺聚糖显著增加，表明该SF-3D水凝胶能够促进软骨的再生。Li等[28]通过3D打印构建出由聚己内酯和SF构成的仿生半月板支架，力学实验表明该3D支架能够承受80%的压缩应变，且抗压强度和抗拉强度均优于纯聚己内酯。进一步的体内实验表明，该3D打印支架能够诱导半月板再生，并在第12周完全被新生组织所替代，而空白对照组未见半月板组织再生。Ni等[29]通过3D打印构建出SF/羟丙基甲基纤维素双层网络水凝胶，研究人员将该水凝胶支架植入动物软骨缺损部位，影像学检查发现，软骨缺损部位有新生软骨形成，通过进一步细胞实验测定软骨细胞表达因子发现，软骨相关基因表达上调，该支架促进了间充质干细胞的增殖和软骨分化。

3 载药SF支架在骨科治疗的应用

3.1 载药SF支架治疗骨肿瘤

对于癌症治疗，药物输送系统正在迅速发展，以克服传统化疗的局限性。传统的治疗方法存在着体内药物浓度分布不均和靶向性不强、水溶性差、治疗指标低等缺点，亟待解决。新型载药支架通过将药物包埋于纳微米级的球状颗粒中，从而控制药物的释放速度，确保药物在局部持续发挥作用，降低药物的全身毒副作用，提高药物疗效[30]，和其他天然高分子相比，SF作为药物缓释材料可塑性优异、生物相容性好、来源广泛、可被生物体降解且降解产物无免疫原性。SF可通过喷雾干燥、盐析、化学交联等工艺制备成纳微米球，并在纳微米球中负载抗肿瘤药物用于骨肿瘤的治疗。Subia等[31]在叶酸偶联SF纳米颗粒上负载了抗癌药物阿霉素，制备出一种直径小于200 nm的SF纳米级叶酸靶向载药微粒支架。实验人员通过人成骨细胞样细胞和乳腺癌细胞共培养，从而模拟出了骨-乳腺癌转移的三维微环境，结果表明和纯阿霉素、非靶向阿霉素组相比，靶向载药支架组的血管内皮生长因子、乳酸显著低于另外两组，说明靶向组抑制了肿瘤细胞的增殖能力。Pierantoni等[32]将辣根过氧化钙负载于SF水凝胶中，通过和人成骨肉瘤细胞共培养，与纯SF水凝胶相比，该载辣根过氧化钙SF水凝胶支架能够有效抑制成骨肉瘤细胞的增殖，小鼠体内植入实验结果表明，该含钙SF水凝胶持续6周释放钙离子。

3.2 载药SF支架预防骨感染

缺损部位的骨组织因骨膜、周围软组织等受到破坏而缺乏血运，对细菌、病毒等微生物的抵抗能力较天然骨组织差[33]，传统骨科内固定材料植入体内后不仅易受到病原体侵袭发生感染，而且在远期植入后易形成无菌性炎症[34]，因此，研制出一种具有预防感染功能的骨科内固定材料尤为重要。Fathi等[35]将负载万古霉素的SF纳米纤维涂层应用于TiO2-NTs，该支架的载药浓度达到31.5 μg/mL，万古霉素的释放时间长达34 d，体外抗菌实验结果显示，和无SF纳米纤维涂层的TiO2-NTs相比，该载药涂层支架抑菌圈直径大，具有对金黄色葡萄球菌增殖的抑制能力，研究人员将具载药SF纳米纤维涂层的TiO2-NTs与MG63细胞共培养，结果表明，载药支架表面有细胞黏附，且细胞形态正常，有丝状伪足，而在未涂层支架上没有细胞黏附和生长。Zhou等[36]将载银纳米粒子和庆大霉素的SF涂层在钛植入支架表面，体外抗菌实验结果表明，和未涂层钛支架相比，该涂层支架能够显著抑制金黄色葡萄球菌的增殖，大鼠缺损模型植入实验结果表明，涂层SF的钛支架植入部位未出现局部感染的症状，Micro-CT结果显示，和未涂层SF钛支架相比，涂层SF的钛支架植入局部有新骨形成，新骨比例达到41.8%±4.0%，该新型支架能够有效发挥抗菌和促进骨缺损愈合的作用。

4 总结与展望

SF作为一种天然的生物材料，它可与其他生物材料结合形成复合支架，模拟自然骨环境，诱导成骨，同时SF作为一种可降解、可调控的蛋白，作为载体在治疗骨肿瘤、预防骨感染中具有巨大的潜能。但将其应用到临床，还有许多问题有待解决，如需要改进制备工艺以适应大规模生产SF，以SF为材料制备的微粒载体，都会有初期爆释药物、后期释放不足、整个缓释时间较短等一系列问题，对于这些问题的研究和解决会是今后的一个重点方向。随着新型的加工技术的发展，基于SF的新支架将在未来有望得到开发，并为其在骨科的应用开辟更多可能。