吲哚菁绿荧光显像技术在胰腺外科的应用

朱倩，杨智勇，袁玉峰

武汉大学中南医院肝胆胰外科 湖北省肝胆胰疾病微创诊治临床医学研究中心，湖北 武汉 430071

胰腺癌是人类恶性程度最高的实体肿瘤之一，发病率逐年上升，死亡率处于恶性肿瘤第5位[1]，到2030年预计将成为全球第二大癌症死亡原因。外科手术是目前唯一可能治愈胰腺癌的手段，文献报道[2]行R0和R1切除的病人术后中位生存时间分别为39.5个月和23.7个月，5年生存率分别为40%和20%，提示胰腺癌切缘对病人长期预后有直接影响。由于往往达不到R0切除，目前根治性手术的存活率仅约15%。荧光显像技术应运而生，在实现肿瘤显像、重要结构可视化及组织灌注状况评估等方面优势显著[3]。胰腺癌的肿瘤血管生成过程中会形成有缺陷的毛细血管，吲哚菁绿(ICG)可从这种新生的脉管系统渗出，因特异性的分子大小、电荷和极性，ICG可存留在肿瘤中，在近红外成像中识别出肿瘤病灶，实时评估肿瘤边界，提高根治切除率。

荧光成像包含靶器官、探针及成像系统3个基本元件。术前或术中通过静脉或者局部注射荧光探针，经过生物代谢到达靶器官，或与其相应的靶点结合。术中使用具有特定波长的激发光照射手术部位，产生另一波段的荧光信号，成像系统捕获后，即可实现肿瘤的显影。ICG是一种既亲水又亲脂的双亲性分子，在体内的半衰期约为3 min，当其水溶液被注入血循环系统后，能够和血液中的白蛋白、脂蛋白等成分结合，选择并高效地被肝细胞摄取，进入胆道的ICG会与胆汁成分结合，并完全排泄出体外，不参与肠肝循环。因此，ICG可用于肝肿瘤定位、胆道显影、血管造影，黏膜下局部注射可经淋巴循环途径应用于淋巴管显影。

ICG亦可用于其他胰腺疾病的诊断。当ICG灌注时，富血供的胰腺肿瘤组织显示出较强的荧光信号，反之贫血供组织则缺少荧光信号。从而可根据血管密度(少、多、几乎无血管)，对临床上常见的胰腺癌、胰腺神经内分泌肿瘤(ICG信号强)、胰腺囊性肿瘤(ICG信号较弱)进行鉴别，丰富了对胰腺病变的检查技术手段，并帮助胰腺外科医生实时辨别胰腺病变范围。相比于传统ICG灌注技术(术中外周静脉注射少量ICG)，“二区ICG信号”技术(术前1～3 d通过静脉注射高剂量ICG)可有效地提供有价值的肿瘤识别与边界评估[3]。

结合临床实践，笔者分类论述ICG导航下肿瘤识别与切缘界定、淋巴结可视化、微转移癌的识别与肿瘤分期及组织灌注的评估等最新进展和热点问题，期待开展相关研究获得临床循证医学证据、规范手术治疗，从而成为提高胰腺疾病诊断与治疗效果的突破口。

一、ICG荧光显像在保留十二指肠的胰头切除术中的应用

保留十二指肠的胰头切除术(Beger手术)，主要用于治疗胰头良性或低度恶性肿瘤、胰头部胰管结石及慢性肿块型胰腺炎，手术安全、可行，具有保留消化道完整性的优势，但术中胆管损伤并不少见。胆管损伤会造成胆漏、胆管狭窄及感染等不良后果，严重影响术后恢复，造成再次手术甚至反复手术的严重后果，严重者还可引起死亡。国内有学者利用术中ICG荧光显像引导腹腔镜胆囊切除术(LC)显影肝外胆道来避免胆道误损伤。胆总管在胰腺的走行分为胰腺背侧型和胰腺内型，胰腺背侧型胆总管在术中通过仔细辨认即可确定，胰腺内型需要在术中通过胃十二指肠动脉后方及门静脉右侧寻找上游胆管，再自上而下解剖胆总管全程。笔者借鉴ICG荧光显像在LC中的成功经验，不管开腹还是腹腔镜下行Beger手术，术中外周静脉注射ICG 1.25 mg(2.5 mg/mL)，通过ICG分子荧光侦测仪器，10 min即可清楚显影胆总管胰腺段，30 min具有最大对比度，能有效避免医源性胆管损伤，同时尽可能多切除胆总管胰腺段的组织，最大幅度降低术后胰瘘的发生率[3]。

二、ICG荧光显像在胰腺肿瘤识别与切缘界定中的应用

肿瘤的完整切除是实现根治性手术的关键。术前常用的影像学检查如CT等不能在术中提供实时影像，不便于术者对肿瘤位置及范围的判断， ICG荧光成像在肝肿瘤识别的应用显示其具备肿瘤可视化的作用。Hutteman等[4]对8例可疑胰腺癌病人施行胰十二指肠切除术(Whipple术)，术中静脉输入ICG，5 mg组与10 mg组的肿瘤/胰腺荧光比值分别为0.89±0.25与1.22±0.39，提示ICG荧光影像并不能提供有效的肿瘤分界。笔者曾于术前半小时静脉注射5 mg ICG进行荧光显像，3例胰腺癌病人均未表现出肿瘤与胰腺组织的荧光强度差异。考虑到低剂量ICG产生的胰腺肿瘤的高渗透及增强效应并不显著，Newton等[5]开展了一项前瞻性临床试验，评估ICG荧光显像对胰腺肿瘤、切缘界定的有效性。20例胰腺癌病人行Whipple术，术前24 h予以2.5～5 mg/kg高剂量ICG注射，荧光成像发现8例非浸润性肿瘤中3例有荧光显影，13例侵袭性肿瘤中12例有荧光显影。在胰腺导管腺癌病人中，91.7%有荧光效果，肿瘤背景比为4.62±2.95，13例侵袭性肿瘤中12例手术切缘荧光与最终病理一致，胰颈边缘荧光阳性预测概率为83.3%，阴性预测概率为100%。由此可见，尽管ICG荧光显像在胰腺癌手术中的应用尚不广泛，但目前研究显示ICG技术对于术中识别胰腺肿瘤及进行切缘界定可能具有较好的应用前景。

三、淋巴结可视化

胰腺癌的侵袭性高，常侵犯血管、神经等胰腺外组织，淋巴结转移是胰腺癌预后不良的一个重要标志[6]。对淋巴结转移识别或区域内淋巴结彻底清扫，可能达到改善预后、提高生存率的目标。Hirono等[7]通过ICG 荧光显像分析Whipple术中胰头的淋巴管引流路径，对20例行Whipple术的病人，术中将ICG注射至胰腺钩突前壁或后壁，在ICG荧光影像实时引导下观察术区淋巴液流动，包括肠系膜上动脉左侧及主动脉区域，确定了7条主要淋巴引流途径，用以明确Whipple术淋巴结清扫范围。Matsuki等[8]利用ICG观察到胰腺的淋巴流动，显示ICG在Whipple术中区域淋巴结清扫的价值。此外，Tummers等[9]通过荧光探针剂量递增的前瞻性研究评估在胰腺癌手术后病人中利用西妥昔单抗-IRDye800荧光成像实现了肿瘤周围淋巴结可视化。结果显示低剂量(50 mg)组检测转移性淋巴结的效果更好，特异度可达78%。更重要的是，能检出肿瘤的隐匿性病灶(直径<5 mm)，灵敏度为88%(15/17个淋巴结)。显示靶向荧光试剂结合荧光成像检测淋巴结转移的巨大潜力。

四、组织灌注的评估

吻合口的组织愈合通常由无张力的吻合口对位与吻合处的血液循环良好共同决定，胰腺癌术后往往由于吻合口愈合不佳容易发生胰瘘等并发症。目前国内外对减少胰瘘所采用的胰肠吻合方法尚无统一意见，但合适的吻合方式、较高的吻合质量是减少胰瘘的关键。其中保证吻合口的良好血运是预防胰瘘的有效方式[10]。通过术中对胰腺组织的灌注评估，及时发现缺血组织，可有效保证吻合口组织的血液循环。Subar等[11]报道1例病人于腹腔镜胰十二指肠切除术(Laparoscopic pancreaticoduodenectomy，LPD)中应用ICG荧光影像技术，胰肠吻合术前予以静脉注射ICG，荧光影像下发现胰腺边缘存在缺血部分，进一步切除后完成吻合，术后病人未出现胰瘘。Rho等[12]报道ICG荧光影像技术具有评估残余胰腺灌注的能力。注射ICG后荧光影像下观察到前壁缺血部分，未进一步处理，术后发生胰瘘。Cai等[13]报道24例胰腺癌病人行LPD，术中应用ICG，仅3例出现胆漏，胰瘘11例(45.8%)，但仅1例(4.2%)出现B级胰瘘，无C级胰瘘，无围手术期死亡。由于目前尚无有效的组织灌注评价工具，因此ICG对胰腺手术中吻合口血流灌注评估的作用优势明显。

五、转移癌识别与肿瘤分期

根治性手术后常出现短期内复发，导致生存率不高，可能是这部分病人手术时已存在远处的微转移，因此，评估胰腺癌的转移在胰腺癌的治疗中非常重要。Yokoyama等[14]评估了ICG荧光显像对识别胰腺癌肝微转移的有效性。对49例术前检查未发现肝脏微转移灶的胰腺癌病人，采用术前静脉注射ICG，术中使用近红外成像系统观察肝脏异常荧光病灶，在13例病人的肝脏内观察到最大直径至少1.5 mm的异常荧光信号，但肉眼却未见明显肿瘤病灶，其中8例(16%) 组织病理学检查证实为肝脏微转移灶。术后6个月内随访结果显示，病理证实肝微转移癌的8例病人中7例有明显肝转移肿瘤(88%)，另外41例中仅4例有明显肝转移瘤(10%)，差异有统计学意义(P<0.05)，5例有荧光显示但未经组织病理学证实的病人中3例肝转移。相关研究进一步证实ICG对发现胰腺癌手术中肝脏微转移的作用[15]。由于ICG对于微转移癌的识别作用，也可将其用于胰腺肿瘤分期的评估，指导临床治疗。Handgraaf等[16]一项腹腔镜近红外影像技术的前瞻性研究，通过术前ICG静脉注射，利用肉眼观察、术中超声及荧光腹腔镜检查转移肿瘤的方法，共发现7例可疑病灶，3例经组织学病理确诊为转移病灶，术中荧光发现2例肝转移(67%)。Yokoyama等[17]报道，术前检查未发现肝转移的133例胰腺癌中，术中发现肝脏微转移20例(15%)，免疫组化进一步证实这20例病人的转移灶组织均表达癌胚抗原(CEA)。由此可见，以ICG为探针代表的荧光显像可以在胰腺术中有效发现肝脏微转移灶。

六、ICG靶向药物的应用

虽然ICG在荧光成像中应用广泛，尤其在肝肿瘤、结直肠癌肝转移中显影明显，但胰腺癌摄取ICG的能力较弱，开发肿瘤特异性靶点及ICG结合的改良ICG试剂，有望提高胰腺癌的术中识别效果。Qi等[18]将透明质酸衍生纳米颗粒与ICG结合形成NanoICG用于术中胰腺癌的近红外荧光检测。在注射NanoICG的原位胰腺导管腺癌模型中，观察到荧光在胰腺内显著积聚，与胰腺非病变部分相比，表现出荧光增强。原因在于NanoICG 对正常胰腺上皮细胞无细胞毒性，没有诱导趋化或吞噬作用。与注射ICG相比，荧光显微镜显示NanoICG在胰腺病变、脾转移中的荧光强度更高。Juhl等[19]将尿激酶纤溶酶原激活剂受体与荧光团ICG(ICG-Glu-Glu-AE105)结合的肽进行荧光成像，验证了其在原位人类异种移植物胰腺癌模型中识别原发肿瘤与转移的有效性。此外其他尚在研究中的靶向荧光药物均表现出对胰腺肿瘤识别的特异性与敏感性，可进一步指导手术切除[20-22]。

Park等[23]报道荧光标记的胰岛素样生长因子1受体抗体，可以显示胰腺癌细胞膜上的荧光灶，实现术中胰腺肿瘤的定位。Neesse通过荧光成像方法，实现了花青染料(Cy5.5)标记的紧密连接蛋白4阳性小鼠胰腺肿瘤病灶的无创可视化，开创了一种新型的早期诊断模式[24]。近来报道一种新型荧光标记的抗CEA抗体[25]，术中发现其特异性地聚集在表达CEA的原发及继发性肿瘤，这对于术中检测原发性胰腺癌和转移瘤是大有裨益的。未来将ICG靶向药物或其他靶向荧光药物临床转化将为荧光显像在胰腺外科的应用带来巨大优势。

七、总结与展望

近年，使用ICG在胰腺癌治疗中的探索正在逐步增多。ICG在胰腺肿瘤定位诊断、微转移灶识别、胰周淋巴结显影、组织灌注评估等方面发挥了巨大的优势。荧光显像作为胰腺癌术中检测的新型、精确的方法，可以使病变组织完整显影从而得到彻底切除，有助于提升手术根治性和减少术后并发症。同时，ICG能够清楚显示病灶周围淋巴结及肝转移病灶，为Whipple术提供一种新的评估方法，在一定程度上有助于胰腺癌术中诊断及治疗。ICG在肿瘤分期中也有一定意义，避免了不必要的手术治疗。

但ICG作为一种非靶向型近红外试剂，胰腺恶性肿瘤对ICG的摄取相当有限，限制了其在胰腺肿瘤手术中的进一步应用。目前能够使用的荧光探针非常有限，且缺乏胰腺癌特异性，但随着众多学者对基于ICG 标记的探针改良和新型探针的研发，这些探针对于胰腺癌早期诊断、术中定位更具有特异性，有助于进一步提升荧光显像技术在胰腺癌治疗中的应用，但进入临床推广还需要更多更高级别循证医学证据。随着荧光显像技术的不断发展，其在胰腺癌的诊断与治疗中会展现出更广阔的前景，并对胰腺癌手术的根治效果与预后产生更加积极的影响。

以外科为主导的胰腺癌综合治疗模式也将迎来重大发展和变革。目前多学科讨论主要依据参与者的临床经验以及有限的循证医学证据，在当前阶段有利于制订个体化的治疗目标、判断手术的最佳时机、明确术后辅助治疗的方案等。笔者提倡积极开展ICG荧光显像技术在Whipple术中应用的相关临床研究，制订相应临床诊断与治疗的专家共识，坚持探索性和规范化并举，在证据积累过程中不断提高规范化共识的级别和水平，从而更快完善胰腺癌综合治疗体系。