影响新型冠状病毒核酸检测阳性检出率的因素

刘 琛，文铖熹

〔1.中国科学院大学深圳医院（光明）医学检验科，广东 深圳 518107；2.中山大学公共卫生学院（深圳）预防医学专业2班，广东 深圳518107〕

2020年2月11日，国际病毒分类委员会宣布将新型冠状病毒（2019-nCoV）正式命名为严重急性呼吸综合征冠状病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）。 世 界 卫 生 组 织（World Health Organization，WHO）同日宣布，将由SARS-CoV-2导致的疾病正式命名为新型冠状病毒肺炎（COVID-19）。目前医学界已确定新型冠状病毒肺炎（新冠肺炎）的传播方式有经呼吸道飞沫传播、直接接触传播、气溶胶传播、粪口传播等[1]。新型冠状病毒属于冠状病毒家族的新成员，为阳性单链RNA病毒[2]。对新型冠状病毒进行分离鉴定是确诊新冠肺炎的主要依据，但各基层医院在对新型冠状病毒进行分离鉴定时常因人员、设备等问题而导致分离鉴定失败，其临床应用的局限性较大。进行新型冠状病毒抗原抗体检测具有操作简便的优点，适用于对大规模人群进行新冠肺炎筛查，但检测过程中存在抗原交叉、血液成分干扰（干扰因子为类风湿因子、非特异性IgM等）等问题。采用核酸检测诊断新冠肺炎的灵敏性和特异性较高，在新冠肺炎的防治中发挥着重要作用[3]。目前全国二级以上医院都开展了新型冠状病毒核酸检测工作，但在检验工作中普遍存在阳性检出率不理想的情况[4]。本文就影响新型冠状病毒核酸检测阳性检出率的因素进行分析和总结。

1 检测前的影响因素

据统计，新型冠状病毒核酸检测过程中的检验质量问题多集中在检验前的阶段[5]，涉及以下几个方面。

1.1 标本采集人员因素

新型冠状病毒具有强传染性，因此核酸采集人员在采集标本时要严格执行三级防护标准，且必须经过系统的采样手法培训。核酸采集人员在采集标本时要做到以下几点：1）采样部位需深入。2）采集的细胞数应足量。3）采集时应避开腺体（腺体分泌物含RNA酶，易降解病毒RNA，导致阳性检出率下降）。核酸采集人员在采集标本时若未严格按照上述要求操作，就会出现采样不合格的情况，进而可影响检测结果[6]。

1.2 病毒保存管因素

RNA酶是一类生物活性非常稳定的酶。除细胞内存在RNA酶外，外界环境中的灰尘、各种实验器皿和试剂、人类皮肤的汗液、唾液中均存在RNA酶。外界环境中的RNA酶易降解新型冠状病毒的RNA，因此在采集标本后应尽量选择添加RNA抑制酶的病毒保存管保存标本，并迅速旋紧盖头。若未采用添加RNA抑制酶的病毒保存管保存标本，就可能导致新型冠状病毒的RNA被降解，影响其阳性检出率。

1.3 呼吸道取样材料因素

有学者采用带病毒保存液的植绒拭子和无病毒保存液的普通棉签拭子对新冠肺炎确诊患者进行标本采集，发现用普通棉签拭子采集的标本新型冠状病毒核酸检测的阳性检出率明显低于带病毒保存液的植绒拭子（P＜0.05）[7]。这可能与植绒拭子易采集更多的口鼻分泌物且在病毒保存液中更易洗脱细胞有关。

1.4 标本来源因素

呼吸道标本包括鼻咽拭子、咽拭子、呼吸道抽吸物、痰液、支气管肺泡灌洗液等。陈炜等[8]研究发现，痰液标本中新型冠状病毒的含量高于咽拭子标本，这可能与新型冠状病毒易侵袭感染下呼吸道和肺有关；咽拭子不易采集到足量的细胞数，以咽拭子为标本进行新型冠状病毒核酸检测的阳性检出率仅有30%～50%。因此，对于接受气管切开术的患者应优先考虑采集其下呼吸道标本进行核酸检测。在采集咽拭子标本时应尽可能多的采集细胞，也可将多部位采集到的标本合并为一份标本进行核酸检测[9]。

1.5 标本转运因素

新型冠状病毒具有强感染性，也易降解，因此应使用密封性好的A类生物安全运输箱（如UN2814）进行冷藏（2℃～8℃）运输，并尽早送检，防止因标本降解而导致阳性检出率降低。

2 检测过程中的影响因素

检测过程中影响新型冠状病毒核酸检测阳性检出率的因素涉及以下几方面。

2.1 标本灭活因素

新型冠状病毒对紫外线和热敏感，56℃下加热30 min、乙醚、75%的乙醇、含氯消毒剂、过氧乙酸和氯仿等脂溶剂均可有效地灭活该病毒[10]。新型冠状病毒实验室检测专家共识建议采用56℃下加热30 min的方式灭活新型冠状病毒。标本灭活处理是生物安全防护的重要措施。目前实验室在检测新型冠状病毒标本前均会对标本实施灭活处理。当标本病毒的浓度较高时，灭活与否对新型冠状病毒核酸阳性检出率的影响不大。但当标本病毒的浓度较低时，进行灭活可导致病毒RNA降解，造成阳性检出率下降[11]。因此在实际工作中应准确控制病毒灭活的温度和时间。

2.2 试剂配制因素

检测新型冠状病毒所用的核酸试剂若配置过久或反复冻融，可导致其中的逆转录酶和DNA聚合酶活性下降，使实验扩增效率降低，进而可导致弱阳性标本出现漏检的情况，影响检查结果。

2.3 核酸提取因素

采用一步法提取新型冠状病毒的核酸可直接将样本加入反应体系，具有操作简单的优点，但漏检率较高，诊断的敏感性较差，不推荐使用。采用手工过柱提取法提取新型冠状病毒核酸的漏检率较低，诊断的敏感性较高，但操作步骤繁琐，耗时久。采用磁珠法提取新型冠状病毒核酸使用的仪器为自动核酸提取仪，具有操作简单、高效、提取核酸浓度及纯度高等优势，可用于大批量新型冠状病毒核酸的提取[12]。

2.4 质量控制因素

在进行新型冠状病毒核酸检测的过程中需设置三阴一阳的质控监测样品，将其随机放在临床标本中间进行检测，当阳性质控样品测定为阳性、3个阴性质控样品全部测定为阴性时，可视为在控[13]。通过试剂盒自带的内标检测，可对标本采集、提取及扩增进行质量控制[14]。无症状感染者、病毒感染初期者及即将治愈出院的患者体内的病毒含量较低，为了提高此类患者新型冠状病毒的阳性检出率，可将阳性质控样品改为弱阳性质控样品。与强阳性质控样品相比，弱阳性质控样品可更灵敏地反映核酸检测体系是否存在假阴性的问题[15]。在对无症状感染者、病毒感染初期者及即将治愈出院的患者进行新型冠状病毒核酸检测时若未使用弱阳性质控样品，可导致阳性检出率偏低。

2.5 扩增试剂因素

不同品牌扩增试剂靶标基因位点的敏感性不同，且不同试剂的脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）、逆转录酶、DNA聚合酶、金属离子、引物序列、探针序列等成分有所差异，可影响检测的准确度和灵敏度。对核酸检测试剂盒的评价，不能仅以其CT值的高低来评估其质量，应综合选择漏检率低尤其是对低浓度核酸具有较高扩增能力的试剂盒进行新型冠状病毒核酸检测，以提高阳性检出率[12]。

3 新型冠状病毒自身特质因素

3.1 病毒变异因素

目前大多数新型冠状病毒检测试剂都是靶向病毒的特定区域，通过逆转录-聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）扩增病毒的ORFlab基因和N基因进行荧光定量检测。但新型冠状病毒属于单链RNA病毒，不稳定、易变异。目前临床上关于病毒基因的变异频率如何、是否存在突变热点等尚未可知。而核酸检测试剂只能根据有限的公开数据进行引物设计，若出现变异病毒混合流行的情况，则易导致检测结果出现假阴性[6]。

3.2 疾病进展因素

无症状感染者、病毒感染初期者及即将治愈出院的患者体内的病毒含量较低，易导致检测结果出现假阴性。若遇到此类情况，应对患者进行多次核酸检测，并联合进行抗原抗体检测，结合患者的临床症状、流行病学史、影像学检查结果等进行综合分析。

4 总结

核酸检测在此次新冠肺炎疫情的诊疗、防治过程中发挥着重要作用，但检测过程易受到诸多因素的影响而导致阳性检出率偏低。在实际检测工作中应从以下几个方面着手，以提高新型冠状病毒核酸检测的阳性检出率：1）正确地采集、运输及保存检测标本。2）选用合适的核酸提取仪器和试剂。3）规范核酸检测流程。4）加强对检测环节进行质量控制。