基于微流控技术的细菌快速检测技术研究

（齐齐哈尔医学院医学技术学院，黑龙江 齐齐哈尔 161000）

1 微流控芯片简介

微流控芯片（microfluidic chip）也称微全分析系统（Miniatrized Total Analysis System，μ-TAS），它是一种以在微米尺度空间对流体进行操控为主要特征的技术产品，在一块芯片上利用可控流体在芯片中流动的原理完成采样、稀释、加试剂、反应、分离、检测等功能，形成一种将实验室中常规化学或生物实验集中在一起的多功能技术平台[1]。微流控芯片技术具有易自动化、试剂消耗少、分离率高、操作简单、装置便携化等突出优点[2]，因而被广泛应用于生命科学的众多领域。

2 传统的微生物检测技术

传统细菌检测方法主要包括直接涂片观察、使用选择/鉴定培养基分离鉴定微生物、分子生物学鉴定和血清学鉴定，但微生物的检测金标准仍然是培养法[8]。平板培养法在各个领域有着广泛的应用，根据细菌的代谢特点，在培养基中加入指示剂，通过颜色变化测定细菌的种类，但该法耗时、操作繁琐、灵敏性较低。

酶联免疫吸附试验（ELISA），在微生物的检测中应用广泛，是利用抗原－抗体发生特异性反应来检测微生物的方法[3]，具有快速、特异的优点，但操作繁琐、试剂样品耗量大，在样品配置、浓缩等步骤耗时较长。聚合酶链反应（PCR）是一种体外特异性DNA 片段扩增的技术，可以实现目标核酸分子的绝对定量，操作简便、快速，具有高度的特异性以及灵敏性，可达到分子生物学在定量分析中重复性和准确性的要求，但本方法在检测前，需要有复杂的样品处理过程，如果处理不当以及变性不彻底极易出现假阴性，并且微生物是否存活无法判定，这是造成假阳性出现的原因。

3 微流控芯片检测技术应用于微生物检测

微流控芯片与介质之间有良好的电绝缘性、散热性、光学性能、可修饰性和生物相容性，可以固载生物大分子，对检测信号干扰极小，其制作工艺简单，成本低廉，装置具有微型化、分析通量高、反应时间短及样品和试剂消耗量少的特点。

3.1 电化学芯片

细菌悬液在负压吸引的作用下，一般会通过检测样孔，此时，由于细菌的体积大小、表面性质等存在差异性，必然会形成不一样的脉冲信号。通过放大、筛选后累计记录，能够将脉冲信号转换成细菌数量、类型等不同的信息。这些年来，电阻抗技术逐渐与微流控芯片研发相融合，将其应用到细菌检测领域中，能够实现动态监测交叉电极室的细菌累积情况。该系统能够实现自动化集中处理，并利用计算机远程控制，对电阻抗的变化情况进行记录，由此来完成细菌检测工作。电化学芯片具有灵敏、快速等检测细菌的优点，细菌通过检测孔时细菌悬液已经过负压吸引，细菌不同的体积大小、不同的表面形状产生的脉冲信号，经放大、分选后累加记录，细菌数量和种类等相关信息被脉冲信号反应出来。与传统的电阻抗芯片相比，电化学芯片可以降低被检测细菌的浓度。

3.2 基因芯片

基因芯片的研发是推动快速、精准检测的一个重要力量。该检测技术是在杂交测序方法基础上拓展而成的，将某种已知的核酸探针固定于基质上，待检测菌的核酸序列与探针形成特异性反应后被捕获，检测核酸的探针序列依靠最大荧光强度的探针分布来确定。基因芯片不受通道尺寸的影响，具有很高的准确度和灵敏度，微流控平台结合PCR 技术则具有高通量、耗材少、耗时短、多分析模块等优势。近年来，美国生物研发企业利用基因芯片分离扩增基因片段，由此创建全自动微生物分型系统，为基因芯片的产量化发展带来了可能。

3.3 化学发光

拉曼广谱属于分子的振动广谱，分子结构的调整能够通过拉曼光谱来呈现出来，同时能够对细菌展开定性与定量分析。与传统的光学检测技术相比，增强拉曼光谱、微流控芯片的结合能够大大提高细菌检测效率。化学发光的原理是利用化学反应过程中产生的光辐射现象。微流控芯片联合化学发光检测技术具有高灵敏度、操作简便、抗光漂白等优势，并且，检测不需要外来的光源，因而大大降低了对设备的要求，易于集成化和微型化。电化学发光既具有化学发光的优点，发光试剂又可以通过电化学的方法循环使用，这符合微流控芯片的发展趋势，在细菌快速、高效检测方面的应用存在很大的发展空间。

3.4 环介导等温扩增技术

环介导等温扩增（loop-mediated amplifica tion，LAMP）技术是用于基因诊断的恒温扩增技术，在链置换型DNA 聚合酶的作用下，对目的基因进行特异、高效的复制，而且操作简便，便于快速检测[4]。环介导等温技术在病毒、寄生虫、耐药基因的鉴定方面应用广泛。LAMP 技术近些年受到学者们的广泛关注，尤其在病毒、耐药基因、细菌、真菌和寄生虫的鉴定方面，其中在细菌检测方面应用最为广泛。Xia 等[5]设计的芯片灵敏性高，能同时检测腊样芽胞杆菌、大肠埃希菌、沙门菌、河流弧菌和副溶血弧菌，并且准确率达100%。

3.5 纸质微流控芯片

纸质微流控芯片是经过多种加工修饰，能够在纸上形成具有一定构造的疏水程度不同的微细网络通道[6]，具有极其便携、价格低廉等优点。但是由于其机械韧性较差，制作的方法复杂，制作的时间过长，因此不利于大规模生产。液体流速控制方法是纸质微流控芯片的中心环节，胡付品等[6]采用纸片扩散法控制流速用来监测细菌耐药性，此方法较自动化仪器法实验结果更可靠。

3.6 化学荧光芯片

化学荧光芯片是将特异性抗原抗体反应、荧光标记、荧光显微镜结合起来的检测技术，能对细菌进行定性或定量分析。与传统的方法相比，节省检测时间、有良好的相容性。

3.7 非接触电导检测分析法

检测器是一种可以检测出色谱柱流出量的变化和组成成分的仪器，其中的电导检测器是离子色谱中最为常用的检测器。电导检测器接触式测量电极表面极易附着气泡，电极表面易玷污，取而代之的是非接触电导检测。其优点：①非接触电导检测系统结构简单，稳定性好，线性范围更宽；②有高速、高效的检测效果；③以微流控技术为基础，具有集成化、高通量、低消耗、便携化等特点；④避免电极与溶液直接接触造成电极污染的问题。

3.8 介电泳分离技术

介电泳技术的特点就在于具有操作方便、响应速度快、非接触、易于实现微型化和自动化等优点。

3.9 化学发光免疫分析法

它具有以下优点：①不需要激发光源；②可以避免使用复杂的光路；③具有极高的灵敏度。

4 微流控芯片的发展趋势及展望

微流控芯片的研究都以某种材料为研究对象进行深层次的研究，但在材料方面多样性和不同的模具类型和模具材料的研究较少，并且现存在多种研究过程中的问题有待于进一步解决。

4.1 发展趋势

微流控技术在细胞生物学及细胞分析研究中发挥着不可替代的作用，相较于传统的细胞培养方法，微流控芯片上的细胞培养能够在时间和空间上使细胞所处的微环境与体内相似，从而获得更真实可靠的结果。微流控技术在心肌损伤标志物检测和与临床相关的多种生化指标监测等方面持续发展，在重要标志物的快速筛查和心血管疾病早期预警等方面具有应用潜力。微流控芯片在病原体检测中的应用研究已初有成效，部分设备已接近或达到临床应用的要求。

4.2 展望

微流控技术能够为细菌检测事业的发展带来极大的推动力。并且，微流控芯片在新药物的合成与筛选、生物医学、食品和商品检验、环境监测、军事科学、刑事科学和航天航空科学等多个领域都有具体应用，微流控芯片的应用还在DNA 测序、核酸分离和定量、基因差异表达分析和基因突变等方面受到关注。此外，微流控芯片也可用于检测染色体DNA 的序列多态型基因变异的位点及特征等，或是用于研究蛋白质结构的分离以及病原微生物的检测等领域。通过检测后，设计和选择出合适的核酸探针，之后通过PCR 扩增获得病原微生物种属、毒力、致病、亚型、抗药、多态型、同源性、变异和表达等信息。微流控芯片中的反应体系体积小，对传感器的灵敏度和稳定性要求更高。特别是检测技术与分析芯片的集成，更是未来研究的趋势，需要付出更多努力来促进微流控细菌检测的发展。希望随着微流控芯片技术不断的发展，其能替代更多的检测仪器，成为我们生活中高效、便携的检测产品。同时，随着3D 打印技术的不断升级，将微流控芯片与其相结合，创建仿生实验室，通过构建感染器官模型，模拟细菌在体内生活的微环境，可对临床分析细菌的病理特点及生理机制等提供参考与支持，这将给临床医学的全面发展带来极大的推动力。