基于纳米材料的电化学免疫传感器及其在蛋白质检测中的研究进展

杨倩雯，刘晓风，曾海娟，王金斌

（1.上海市农业科学院生物技术研究所，上海 201106；2.兰州理工大学生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730050）

以蛋白质为靶标的检测技术广泛应用于疾病诊断、药物研究、食品及环境中有毒有害物质的分析。蛋白质的常规检测方法大体分为两种：一种是依据含氮量推算蛋白含量，如凯氏定氮法、杜马斯定氮法；另一种是以蛋白质的物理化学性质为基础，采用相关仪器设备进行检测，如分光光度法、甲醛滴定法。然而常规检测技术普遍存在成本高、耗时长、灵敏度低、操作复杂等问题，因此研究者在不断探索低成本、高灵敏度、操作简单的新型检测方法，来弥补常规检测技术的不足。

目前已有大量研究报道了蛋白质的检测方法，其中不乏一些操作快速、简单的检测方法，如毛细管电泳法、近红外光谱法、共振瑞利散射光谱法、生物传感器法等。其中免疫传感器是目前检测蛋白质最重要且应用最广的生物传感方法。与常规检测方法相比，免疫传感器具有灵敏度高、特异性高、耗时短、造价低、易携带、操作简单等多重优点[1]。免疫传感器通过两个途径以提高检测物质的灵敏性：一是联合电化学分析技术，如循环伏安法、差分脉冲法、脉冲伏安法等[2]；二是选用良好的电极修饰材料，通过增加峰电流从而提高传感器的灵敏度。

随着纳米材料在免疫传感器中的不断发展，研究者们重点集中于研究纳米材料的选择、复合纳米材料的制备以及如何实现新型纳米材料的信号放大，纳米材料在免疫传感器的应用为提高其检测灵敏度带来很大的突破，并使其具有更广的应用前景。本文通过总结免疫传感器构建原理及目前纳米材料在免疫传感器中的应用，汇总免疫传感器在蛋白检测中的应用，并对目前免疫传感器的不足及未来发展方向展开讨论，以期为蛋白质的快速检测提供技术参考。

1 电化学免疫传感器概述

电化学免疫传感器是一种连续、可逆的感受生物量和化学量的装置。电化学免疫传感器是利用免疫技术结合各种电化学分析方法的免疫分析法，综合了电化学分析技术的高灵敏性和免疫分析技术的高选择性和特异性。其原理是将抗原（抗体）固定在基底电极表面，利用抗体-抗原间的相互作用发生免疫反应，使电极及缓冲液的电性发生变化，从而转变为可检测信号如电流、电势及阻抗来确定目标检测物的浓度[3]，并以此划分为电流型[4]、阻抗型[5]和电位型[6]免疫传感器。

1.1 电流型免疫传感器

电流型免疫传感器是免疫技术与电化学检测相结合的标记型免疫分析，它是将生物识别元件通过单一抗体或双抗体夹心方法的方式发生免疫反应并修饰在传感器表面，同时清洗去除表面的非特异性吸附，最终通过测定免疫反应引起的电流变化实现对目标的检测。最早构建的电流型免疫传感器是用于检测人绒毛膜促性腺激素[7]。随着研究的不断推进，利用电化学方法检测肿瘤标志物的研究日益增多，电流型免疫传感器也因此取得很大的进步。至今，电流型免疫传感器的标记物分为生物酶（如碱性磷酸酶、乳酸脱氧酶、葡萄糖氧化酶、尿素水解酶等）和电活性物质（如二茂铁、对氨基酚及其衍生物、金属离子、聚苯胺等）。王曼丽等利用Pt-Pd双金属纳米材料修饰石墨烯作为载体，固载已标记的抗体分子，构建高特异性、高灵敏的电流型免疫传感器[8]。Liu Tingzhi等以有机框架材料作为基底，构建了一种超灵敏的夹心式免疫传感器，用于检测C反应蛋白[9]。因电流型免疫传感器具有高选择性、高灵敏度等优点，现广泛用于医学、食品和环境等领域中蛋白质及一些小分子物质的检测中。

1.2 阻抗型免疫传感器

阻抗分析方法能够分析电极表面物质的反应特性[10]，抗原-抗体发生反应后会降低电极表面的电子转移速率，阻抗增加，可通过测定反应前后的阻抗变化来判断被检测物的浓度。阻抗谱包含一段半圆曲线和一段直线，分别出现在高频区和低频区，电子转移速率控制半圆曲线部分，电荷扩散影响直线部分。阻抗型免疫传感器能够灵敏地表征电极表面的变化，应用前景广阔。Cordeiro等研制了首个无标记电化学阻抗免疫传感器，使用印刷电极检测婴儿利什曼原虫抗体，成功研制出一种灵敏、快速、便捷的免疫传感器，用于利什曼病的诊断[11]。游凯豪等构建了非标记阻抗型免疫传感器用于检测转基因蛋白Cry1AC，检测限可达0.8 ng/mL[12]。

1.3 电位型免疫传感器

电位型免疫传感器具有高灵敏度、高选择性，可以直接或间接检测抗原（抗体），做到实时快速检测。常用的气敏电极为CO2、NH3、O2等，离子选择电极为氟离子电极、三甲基苯胺阳离子电极和电离子电极等。不同蛋白质的等电点不同，在免疫反应发生前后电极表面的极性和密度都会随之发生变化，最终使得电位发生变化，电位型免疫传感器便是基于反应前后电位变化进行免疫分析。Silva等以金纳米颗粒（gold nanoparticles，AuNPs）聚合物包合膜实现信号放大，构建了无标记的电位型免疫传感器用于鼠伤寒沙门氏菌的高灵敏检测[6]，在此基础上，Silva等研发了一种新的基于纸张的无标签电位免疫传感器用于检测鼠伤寒沙门氏菌，以纸为基础的条形电极与滤纸垫集成，设计了一种简单经济的方法控制通过聚合物膜的离子通量，通过电化学阻抗谱用来评估修饰步骤及分析检测结果[13]。

2 纳米材料在免疫传感器中的应用

纳米材料具有一系列优异的光学特性，其在免疫传感器中的应用大大提高了传感器的性能，功能化的纳米复合材料不但能加速信号传导，同时还能放大识别信号[14-16]。目前免疫传感器技术已逐步成熟，主要有3 种机制被用来提高免疫传感器的灵敏度：1）利用新型纳米材料的大比表面积和电子转移能力，尽可能增大修饰电极的比表面积并提高电子转移率；2）利用生物相容性使纳米材料与蛋白相结合，通过作为受体分子和酶标抗体的纳米载体来放大免疫反应；3）利用新型纳米材料本身特性作为生物探针实现放大信号的作用，例如碳纳米材料、有机框架材料、金属纳米粒子及其复合物。图1为纳米材料电化学传感器构建技术原理。目前，广泛用于免疫传感器具有代表性的纳米材料有富勒烯（C60）、碳纳米管、石墨烯、类石墨烯材料、半导体量子点、金属有机框架材料（metal-organic frameworks，MOFs）等。随着研究的不断推进，越来越多的新材料被用于电化学免疫传感器的构建中。

图1 纳米材料电化学传感器构建技术原理Fig. 1 Schematic diagram of the construction of nanomaterial electrochemical sensors

2.1 碳纳米材料

2.1.1 富勒烯

富勒烯（C60）是一种碳单质球形纳米材料，其高度对称的结构使其具有独特的光电性能，生物相容性优异，自被发现以来便受到广泛关注。在电化学领域，将C60及其复合物用于电化学传感器的构建，其大比表面积和超导性增强了电信号，大大提高了传感器的灵敏度，成为目前新型纳米材料的研究热点。Demirbakan等[17]用C60修饰电极，并将抗体通过试剂偶联在C60层上，采用循环伏安法和电化学阻抗法对过程进行表征并测定热激蛋白70，所得传感器的检测范围为0.8～12.8 pg/mL。Anusha等[18]通过C60和铜镍双金属纳米粒复合修饰电极构建传感器，用于检测血液中VD的浓度，实验结果显示检测限为0.002 5 μmol/L。

2.1.2 碳纳米管

碳纳米管是一种由石墨烯片层卷构形成的一维纳米材料，依据结构分为单壁碳纳米管（single-walled carbon nanotubes，SWCNTs）和多壁碳纳米管。碳纳米管化学性质稳定，具有较大的比表面积、优良的导电性和较好的生物相容性，同时，其独特的结构使其易于被功能化。功能化的碳纳米管在其原有的特性上具有更佳的光电性能，增强了对物质的吸附能力[19]，可连接特定的基团从而对某种物质进行特异性吸附。Gulati等[20]利用垂直排列的多壁碳纳米管构建了免疫传感器用于耐药白血病细胞的检测，使用阿霉素对白血病K562细胞进行检测，检测限为10 个/mL，该方法具有良好的稳定性、重现性和快速检测等优点。Rizwan等[21]通过由AuNPs及SWCNTs等组成的复合材料构建了高灵敏的免疫传感器，用于临床肿瘤标志物癌胚抗原的检测。在电化学分析中，碳纳米管作为一种电极材料，大大提高了检测的灵敏度和特异性，成为电化学传感器研究的热点。

2.1.3 石墨烯

石墨烯是目前应用十分广泛的一种二维碳纳米材料，具有良好的导电导热性能，比表面积大。石墨烯独特的结构使其化学性质稳定且易于功能化。在电化学传感领域中，石墨烯因其优异的导电性能，大大提高了传感器的灵敏度，同时，功能化的石墨烯为特异性识别提供了条件。Ren Qunxiang等[22]基于氧化石墨烯和AuNPs修饰电极，构建了一种高灵敏的免疫传感器，用差分脉冲法在pH 7.4的缓冲液中检测三聚氰胺，在最优条件下，检出限达到2.66×10-7μmol/L。Fan Yan等[23]合成氧化石墨烯/硫堇/AuNPs纳米复合材料，涂覆于电极表面，用于糖类抗原125抗体固定和检测信号的放大，检测限为0.01 U/mL，结果表明，这种免疫传感器检测的血清样品与传统酶联免疫吸附试验检测的结果一致，相对误差小于8.05%，且具有良好的重复性、稳定性和准确性。石墨烯由于制备方法简单、快速、成本低，已经成为构建免疫传感器的首选纳米材料之一。

2.2 类石墨烯材料

类石墨烯材料是一类厚度为几纳米的二维纳米材料，其原子的不同排列方式导致了性质的不同，致使它们广泛应用于诸多领域。类石墨烯材料主要包括氮化硼（BN）、过渡金属氧化物及过渡金属硫化物，其中，应用较多的有二硫化钼（MoS2）、二硫化钨（WS2）等。

2.2.1 二硫化钼

MoS2作为一种典型的过渡金属硫化物，具有独特的物理和化学性质。纳米MoS2性质稳定，具有较大的比表面积，其吸附性能强，在电化学领域具有很大的应用潜力。合成方法的不同，将导致传感器性能的不同，MoS2的合成分为自上而下法（液相超声法、锂离子插层法和微机械剥离法等）和自下而上法（化学气相沉积法和水热法）。纯MoS2导电性差，常与其他导电材料合成复合纳米材料，以增强其导电性[24]。常用于组合的纳米材料包括碳纳米管、AuNPs及磁性纳米粒子等。Zhu Dan等[25]通过MoS2-Ti-AuNPs纳米复合材料构建了生物传感器，用以检测microRNA-21，AuNPs的加入增强了其导电性。Cao Xiaoyu[26]制备了AuNPs/MoS2/石墨烯纳米复合材料，实现了信号放大作用，能高灵敏地检测DNA。

2.2.2 二硫化钨

WS2是一种形状类似三明治的层状材料，由于原子排列方式和层间堆垛方式的不同，WS2具有不同的结构，有一定还原性。WS2较强的表面效应和较大的比表面积使其广泛应用于各个领域，是近年来热门研究的新型纳米材料之一。Kong Weisu等[27]以AuNPs/WS2纳米棒阵列修饰电极、银纳米粒子/片状锌金属-有机骨架（Ag/ZnMOF）纳米酶为载体，构建了一种超灵敏光电生物传感器，用于检测博来霉素，检测限为0.18 nmol/L。Zhang Zhouxiang等[28]基于SWCNTs纳米复合二维层状硫化钨纳米片构建了高灵敏的电化学传感器，用于检测VB2，将含有氧化石墨烯的SWCNTs分散液滴涂于电极表面，用WS2改善其结构的致密性和平稳性，成功地应用于VB2药物样品的检测中，检测限为0.7 nmol/L。

2.3 荧光纳米材料

2.3.1 量子点

量子点是近期发现的能够产生荧光的纳米级半导体颗粒。目前研究较多且具有巨大应用前景的量子点为CdX（X＝S、Se、Te）。量子点独特的光吸收特性，如量子表面效应、尺寸效应、量子隧道效应及介电限域效应等，使其具有稳定性好、荧光寿命长、荧光强度高、可多次激发等优势。这些优势成功引起研究者的关注，将其作为荧光标记探针应用于各领域，成为最具潜力和应用价值的新型纳米材料。电致发光则是利用量子点优异的光电性能，将光与电化学分析相结合，形成一种十分灵敏的检测方法。Qiu Youyi等[29]在电极表面加载聚苯胺，以CdS量子点为发光信号源，并利用AuNPs固定MCF-7肿瘤细胞，实现了肿瘤细胞的检测。Cadkova等[30]将CdSe/ZnS量子点与抗体偶联构建了一种无酶量子点磁免疫传感器，实现了对人血清附睾蛋白4的高灵敏检测，检测限达到12 pmol/L。

2.3.2 荧光碳点

碳点是一种零维的半导体纳米材料，粒径一般小于10 nm。碳点具有独特的光学性质，易于功能化，且具有良好的生物相容性、稳定性、低毒性等优点。同时，制备碳点的原料种类丰富、价格低廉，逐步成为研究者的焦点，在传感器的应用中具有很好的应用前景。基于碳量子电池碳量子点构建的电化学发光传感器逐步受到关注，其因独特的光电特性，被用于构建荧光探针应用于各种分析物的高灵敏检测，包括金属离子[31]，生物分子[32]及杀菌剂[33]等。随着对碳点研究的深入，更多的方法被用来提高分析的特异性和灵敏度，比如在碳点表面偶联具有特异性识别作用的适配体及分子印迹聚合物，而碳点也逐步被广泛应用于蛋白质的研究中，实现了对特定蛋白的标记和高灵敏分析。

2.3.3 金属有机框架材料

MOFs是有机配体和金属离子或团簇发生配位而构建形成的新型多孔材料，结合了无机材料与有机材料的优点。其独特的结构决定了MOFs具有比表面积大、热稳定性和化学稳定性良好、孔径结构可调、吸附性能良好等特性，因而倍受关注。改性MOFs制备出的复合材料可使其更有效地检测生物分子、阴离子、阳离子、有机化合物等不同物质，因此，MOFs成为构建灵敏传感器的最佳候选材料[34]。由于MOFs的巨大空体积限制了其导电性，且其中大多属绝缘材料，选择合适的材料与MOFs结合修饰，可使MOFs具有独特的光电特性。MOFs纳米复合材料现已被用于多种重要分析物的传感检测，用于合成MOFs纳米复合材料进行光电电化学检测的材料主要包括碳基材料、金属/金属氧化物纳米颗粒、量子点、酶和杂多酸[35]。

Li Jun等[36]用石墨烯制备复合材料检测对苯二酚和邻苯二酚等污染物，超声分散Cu-MOF和氧化石墨烯，并滴于电极表面室温干燥，结果表明Cu-MOF-氧化石墨烯复合材料在检测中表现出良好的性能。He Yi等[37]利用AuNPs将MOF-CoFe2O4磁性纳米粒子功能化，合成MOFCoFe2O4＠AuNPs夹心型免疫传感器，用以检测N端脑前列钠肽。何晓静等[38]基于MOFs固载碲化镉量子点（CdTe quantum dots，CdTe QDs）合成CdTe＠MOFs/CdTe QDs复合物，构建电致发光免疫传感器，用以检测心肌肌钙蛋白I。

除了上述几种常见纳米材料，应用于电化学传感器研究中的纳米粒子还有贵金属纳米粒子（如金、银、钯、铂等）、纳米金属氧化物及纳米复合材料。贵金属纳米材料在具有纳米材料特性的同时还具有金属自身的物化性质，成为纳米材料研究领域中的热点，吸引许多学者在其制备、性能及应用方面不断探索研究并取得一定成果。如银纳米材料能够快速促进电催化，加速电子转移速率，实现待测物的灵敏检测[39]。Wang Zihua等[40]构建了一种以AuNPs、硫堇、羧化多壁碳纳米管复合材料为底物的免疫传感器用于检测白细胞介素-6。随着对贵金属纳米粒子研究的深入，一种新型荧光贵金属纳米簇被发现，其具有在可见光到近红外光区范围内荧光可调谐的优良光学性质[41]，被广泛应用于各个领域[42]。

3 电化学免疫传感器在蛋白质检测中的应用

随着研究者的不断努力，越来越多便捷快速的检测方法出现并应用于蛋白质的检测中，如表1所示，每种检测方法都有一定的缺陷，而与其他检测方法相比，电化学传感器攻克了高成本、低灵敏度、易受干扰等问题，广泛应用于各个领域的蛋白质检测中。

表1 常用蛋白质检测方法Table 1 Common protein detection methods

3.1 食品分析

3.1.1 食品过敏原检测

食品过敏原是能够引起宿主对食物产生不良反应的一类物质，主要为来源于海鲜、大豆、牛奶、蛋品等食物中的蛋白质[43]。聚合酶链式反应和免疫学分析是检测食物中过敏原的主要方法。随着检测技术的不断发展，传感技术逐渐应用于食品中过敏原的检测。Yang Chi等[44]用氧化锌-量子点复合材料修饰电极构建了伴刀豆蛋白标记的传感器，用于检测过敏原鸡卵类黏蛋白。Eissa等[45]将石墨烯修饰于电极表面，羧基活化后连接卵白蛋白抗体构建卵白蛋白免疫传感器，对蛋糕提取物中的卵蛋白进行检测，此外该作者用同类免疫传感器对牛奶中的过敏原β-乳球蛋白进行检测[46]，其检出限和检测范围都达到了令人满意的结果。Montiel等[47]将磁性微球羧基化后修饰于电极表面并连接花生蛋白Ara h1抗体，然后逐层固定花生蛋白Ara h1、标记抗体和标记辣根过氧化物酶，得到双重信号放大的免疫传感器。Kong Weijun等[48]将纳米粒子和壳聚糖混合液修饰于电极表面形成氨基薄膜，固载AuNPs得到发光型免疫传感器，进而得到卵转铁蛋白浓度与发光强度的线性关系。

3.1.2 牛奶蛋白检测

酪蛋白是牛奶营养的主要成分，酪蛋白含量是判断乳品中是否掺假的重要指标。电化学传感器在牛奶检测中的应用克服了传统检测方法成本高、耗时长、需专业人员操作等弊端。免疫传感器的应用能够有效、高灵敏地检测牛奶中的酪蛋白。Cao Qian等[49]基于AuNPs/多壁碳纳米管构建了免疫传感器用以检测酪蛋白，并对AuNPs的吸附时间、电解质pH值和孵育时间进行了优化，最终检测限达到5×10-8g/mL。

3.1.3 农作物中转基因蛋白检测

目前，针对转基因蛋白的检测并没有许多高效灵敏的检测方法，电化学免疫传感器在转基因蛋白检测中的应用，逐渐成为研究热点。Zhu Xiaolei等[50]基于量子点构建了荧光酶联免疫传感器，用以检测转基因MON810玉米的Cry1Ab蛋白。游凯豪等[12]构建了非标记阻抗型电化学免疫传感器，对转基因作物及产品中Cry1Ac蛋白含量进行了检测，最低检测限达到0.8 ng/mL。Gao Hongfei等[51]将鲁米诺作为信号探针构建了电致化学发光免疫传感器，对转基因蛋白Cry1Ab进行了定量检测，且该传感器成功用于实际转基因作物的检测中。由于转基因作物的种植与安全性受到公众的高度重视，电化学传感器检测转基因作物的方法仍需更多深入的研究以普及到实际应用中。

3.2 医疗检测

近年来免疫传感器用于蛋白检测的报道不断涌现，表2对部分用于检测蛋白质的电化学传感器进行了总结。

表2 电化学传感器用于蛋白质检测Table 2 Electrochemical sensors used for protein detection

在临床诊断中，许多蛋白被用作一些疾病的识别，通过对高特异性的标记蛋白进行检测而确诊疾病。Tau蛋白是一种微管相关蛋白，聚集于神经性疾病的细胞内。国外对于应用传感器检测Tau-381蛋白质的研究也相对较少，Esteves-Villanueva等[56]同样构建了生物传感器来检测折叠的Tau蛋白。Derkus等[57]利用纳米免疫传感器检测到了0.15 nmol/L Tau蛋白。Dai Yifan等[58]构建了一种一次性的生物传感器，用于检测人体血清中的Tau蛋白。Xu Wei等[59]合成了纳米盒金属-有机骨架复合材料，并应用于免疫传感器中，利用SiO2标记抗lag3抗体，对淋巴细胞活化基因3（lag 3）蛋白进行超敏定量检测，检测限为1.1 pg/mL。Gao Ning等[60]通过水热法合成Zn∶SnO2/SnS2纳米复合材料，构建了无标记光电化学免疫传感器用以检测β淀粉样蛋白，Zn的加入显著提高了电流值，最终检测限低至0.05 pg/mL（信噪比为3）。

近年来对靶标蛋白质分子的检测主要依赖于免疫学方法，常规的免疫学方法难以准确检测低浓度靶标蛋白质，而免疫传感器的应用弥补了这一缺点。电化学免疫传感器结合了抗原抗体的特异性反应和新型纳米材料的优质特性，能够做到高选择性、高灵敏性、快速、简便地检测，在蛋白质检测中具有广泛的应用前景。

4 结 语

基于纳米材料的不断研究，越来越多的新型材料用于免疫传感器的构建中，极大地提高了检测的灵敏度。荧光纳米材料以其特有的光学性质广泛应用于蛋白质的快速检测中，其中磁性荧光纳米材料合成技术成熟但在蛋白质检测中应用较少，未来仍有巨大的发展空间。更多基于新型有机、无机纳米材料构建的免疫传感器正逐步应用于蛋白质的检测中，选用合适的修饰材料后，如何用最简便的方式极大地实现信号放大成为目前研究的一个挑战，随着技术的不断发展，未来在蛋白质检测领域仍需以下优化：1）提高电极的品质和灵敏度，在此基础上研究新型传感器，使其便于携带；2）进一步开发导电性强、生物相容性高、环保的新型纳米材料；3）进一步优化电化学免疫传感器的信号放大策略，简化探针构建过程，实现超灵敏检测；4）发展微型化的多电极模式，提高检测通量。