壳聚糖/磺丁基-β-环糊精纳米粒子的制备及其对海藻酸钠膜物理性能的影响

孙伟艳，宿志伟，张 芳，孟祥红，刘炳杰

（中国海洋大学食品科学与工程学院，山东 青岛 266003）

壳聚糖（chitosan，CS）是甲壳素脱乙酰化的产物，是唯一一种阳离子多糖[1-2]。因其天然无毒且具有良好的抑菌性能，近年来被广泛应用于生物医药工程、基因载体、食品以及化妆品等诸多行业[3-4]。CS具有一定的成膜性，具有防腐保鲜的作用，可以用于食品的包装来延长食品的贮藏期[5]。

与蛋白质、脂质等材料相比，CS来源广、成本低，其带有正电的氨基基团能够与三聚磷酸钠、环糊精等带有负电基团的物质结合形成纳米粒子，通过氨基基团能够调节pH值，从而完成荷载药物的释放，因此CS可以作为一种理想的壁材用来包埋活性物质。有研究表明，在不同制备条件下获得的CS纳米粒子的粒径、多分散系数（polydispersity index，PDI）与稳定性会有很大不同，而纳米粒子的粒径会对抑菌性有一定影响[6-8]。Mohammadi等[6]用3 种不同分子质量的CS制备获得粒径不同的纳米粒子，结果表明，CS分子质量越小，纳米粒子粒径越小，抑菌性越好。Fan Wen等[9]探究了CS与三聚磷酸钠的质量比对纳米粒子粒径的影响，结果表明，当CS与三聚磷酸钠的质量比为3∶1时，可以获得粒径最小的纳米粒子。Du Zhiyang等[10]发现纳米粒子粒径会随CS添加量的增加而逐渐增大。磺丁基-β-环糊精（sulfobutylether-βcyclodextrin，SBE-β-CD）能够与CS发生较强的交联作用，且通过前期预实验发现，SBE-β-CD与CS通过离子交联作用形成的纳米粒子在均一性方面要明显优于三聚磷酸钠与CS作用形成的纳米粒子。CS/三聚磷酸钠纳米粒子对小分子水溶性物质和疏水性物质的包埋效果不佳，而SBE-β-CD是由α-D葡萄糖单元通过α-(1→4)糖苷键形成的环状低聚糖，是一种带有内腔分子结构的物质，因此不仅能够包封水溶性差的物质，还能促进某些水溶性物质的包封。

随着人们对环境保护和可持续发展要求的不断提高，以多糖为原材料制备的可食性包装膜得到了广泛的推广与应用。海藻酸钠、明胶、CS等天然多糖具有良好的成膜性，同时具有可降解、可再生、低毒等环保优势，因而被广泛研究[11-12]。董晓萌[13]以海藻酸钠为膜基质制备了复合可食性包装膜，该膜具有良好的机械性能和物理性能。Liu Yuntao等[14]通过对CS分子质量和质量浓度对CS溶液成膜性能进行探究发现，CS质量浓度与分子质量越高，膜的拉伸强度越大，机械性能越好。

单纯的CS与海藻酸钠膜水蒸气阻隔性能差、成膜后脆性大，导致二者难以直接用于包装膜材料的制备[15-19]。有研究表明，CS通过制备成纳米粒子添加到其他膜基质中能够很好地改善膜的机械与物理性能[20-24]，且对环境非常友好。刘飞[25]以明胶为膜基质，通过添加CS纳米粒子来改善明胶膜的机械性能与物理性能。本实验通过离子交联法制备获得CS/SBE-β-CD纳米粒子，并将其添加到海藻酸钠溶液中，通过流延法制备CS/SBE-β-CD纳米粒子-海藻酸钠膜，研究CS/SBE-β-CD纳米粒子添加量对复合膜物理性能、机械性能的影响，为CS/SBE-β-CD纳米粒子在可食性复合膜的研究中提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

CS（分子质量100 kDa，脱乙酰度95%） 青岛海普生物技术有限公司；SBE-β-CD（化学纯） 昆山瑞斯克化工原料有限公司；溴化钾（光谱纯） 天津科密欧化学试剂有限公司；海藻酸钠（化学纯）、冰醋酸（分析纯）、吐温-80（分析纯）、甘油（分析纯）国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

Nano ZS90型粒度仪 英国马尔文仪器公司；BS 124S型电子天平 北京赛多利斯有限公司；LCD数控加热型磁力搅拌器、LCD数控水浴加热型磁力搅拌仪大龙兴创实验仪器有限公司；JEOL 2100透射电子显微镜（transmission electron microscope，TEM） 德国Bruker公司；ST 16R型台式冷冻离心机、Nicolet iS10傅里叶变换红外光谱仪（Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR） 美国Thermo Fisher Scientific公司；LRH-100-S恒温恒湿仪 韶关市泰宏医疗器械有限公司；数显膜厚度测定仪 上海六菱仪器厂；DHG-9140A电热鼓风干燥箱 上海培因实验仪器有限公司；TMS-TOUCH型质构仪 美国FTC公司；IS-RDS 3叠加式恒温振荡器美国精骐有限公司。

1.3 方法

1.3.1 CS/SBE-β-CD纳米粒子的制备

参照Bodmeier[26]和Roy[27]等的方法并稍有修改制备CS/SBE-β-CD纳米粒子。将CS溶解于体积分数1%乙酸溶液，利用0.45 μm的滤膜除去不溶性的CS，用5 mol/L NaOH溶液调节pH值，得到CS溶液。SBE-β-CD溶于超纯水后得到4 mg/mL的溶液，将其在40 ℃恒温水浴条件下加入至CS溶液中，1 000 r/min磁力搅拌25 min后10 000 r/min离心30 min，取沉淀进行真空冷冻干燥得到CS/SBE-β-CD纳米粒子。

1.3.2 单因素试验

以CS分子质量（50、100、200、300、500 kDa）、CS溶液pH值（3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0）、CS质量浓度（0.50、0.75、1.00、1.25、1.50 mg/mL）、CS与SBE-β-CD质量比（0.55∶1、0.6∶1、0.75∶1、0.8∶1、0.9∶1、1∶1）为单因素，分别探究各因素对于CS/SBE-β-CD纳米粒子粒径、PDI和Zeta电位的影响（在CS分子质量100 kDa、CS溶液pH 4.0、CS质量浓度0.75 mg/mL、CS与SBE-β-CD质量比0.8∶1条件下，保持其他因素不变，只改变其中一个因素）。通过对纳米粒子粒径、PDI和表面Zeta电位的分析（测定对象为1.3.1节中1 000 r/min磁力搅拌25 min后得到的溶液），得到最佳制备条件，再对最佳制备条件得到的纳米粒子进行TEM观察和FTIR分析。

1.3.3 CS/SBE-β-CD纳米粒子粒径和表面Zeta电位的测定

利用基于动态光散射技术的Nano ZS90型粒度仪测定CS/SBE-β-CD纳米粒子的粒径、PDI和Zeta电位，固定散射光角度为90o，测定温度为（25±1）℃。

1.3.4 CS/SBE-β-CD纳米粒子的TEM观察

将制备好的CS/SBE-β-CD纳米粒子溶液均匀地滴加到TEM铜网上，用2%磷钨酸染色后在常温下干燥后立即进行TEM观察，透射加速电压为100 kV[28]。

1.3.5 CS/SBE-β-CD纳米粒子的FTIR分析

采用溴化钾压片法，分别测定CS粉末、SBE-β-CD粉末、CS与SBE-β-CD按质量比约1∶1的物理混合物以及CS/SBE-β-CD纳米粒子的FTIR图。扫描范围为400～4 000 cm-1，扫描次数为32，分辨率4 cm-1。

1.3.6 CS/SBE-β-CD纳米粒子-海藻酸钠复合膜的制备

参照刘飞[25]的方法制备CS/SBE-β-CD纳米粒子-海藻酸钠复合膜。准确称取海藻酸钠于超纯水中，室温溶胀1 h后于40 ℃温度下磁力搅拌至充分溶解后添加甘油继续搅拌至均匀，再向其中添加CS/SBE-β-CD纳米粒子充分混合搅拌，使得海藻酸钠终质量浓度为1.5 g/mL，甘油质量浓度为0.3 g/100 mL，CS/SBE-β-CD纳米粒子质量浓度分别为0、0.25、0.50、0.75、1.00 mg/mL。将50 mL膜溶液通过溶液浇铸法倾倒入10 cm×10 cm的方形有机玻璃平皿中，35 ℃条件下烘干36 h左右，待膜烘干后揭膜，将复合膜置于25 ℃、相对湿度53%的恒温恒湿仪中平衡2 d后备用。

1.3.7 CS/SBE-β-CD纳米粒子-海藻酸钠复合膜的性能测定

1.3.7.1 厚度的测定

选择光滑平整的复合膜样品，在样品的中心与四周随机选择10 个点，通过数显膜厚度测定仪测定膜的厚度，单位为μm。

1.3.7.2 机械性能的测定

将膜样品裁剪为2 cm×6 cm的长方形膜片，通过质构仪测定膜的机械性能。测量参数为：初始间距20 mm、拉伸速率为1 mm/s。每组样品测5 次平行[29]。分别按公式（1）、（2）测定拉伸强度、断裂延伸率。

式中：F代表膜的最大拉力/N；W表示膜宽度/mm；T表示膜厚度/mm；L1代表膜的伸长量/mm；L0表示膜的原始长度/mm。

1.3.7.3 水蒸气透过率的测定

将6 g无水氯化钙加到25 mm×40 mm称量瓶中，然后将样品覆盖于称量瓶瓶口上，在25 ℃、相对湿度75%的条件下每4 h称质量一次[30]。按公式（3）测定水蒸气透过率（water vapor permeability，WVP）。

式中：Δm/Δt表示每小时称量瓶质量的变化率/（g/h）；T表示复合膜厚度/mm；A表覆盖在称量瓶上膜的面积（即瓶口面积）/m2；Δp代表复合膜两侧的水蒸气压差/kPa。

1.4 数据统计与分析

除特殊说明外，每处理组实验至少重复3 次，结果以平均值±标准偏差表示。使用SPSS Statistics 22软件进行单因素方差分析，并进行Duncan多重范围检验，P＜0.05表示差异显著。用Origin Pro 9.0软件绘图。

2 结果与分析

2.1 不同制备条件对CS/SBE-β-CD纳米粒子影响

2.1.1 CS分子质量对CS/SBE-β-CD纳米粒子粒径、PDI和Zeta电位的影响

PDI越小，纳米粒子溶液的均一性越好；Zeta电位越高，溶液的稳定性越好[31]。本实验以CS/SBE-β-CD纳米粒子粒径为纳米粒子制备条件选择的主要指标，同时在粒径没有明显差异的条件下，结合Zeta电位与PDI作为纳米粒子制备条件的参考。从图1可以看出，随CS分子质量的增大，CS/SBE-β-CD纳米粒子的粒径增加，这是由于CS是一种高分子化合物，随着CS分子质量的增大，CS分子链长度增加，导致分子链之间的空间位阻和溶液的黏度增加，进而造成CS分子之间更容易聚集而形成更大粒径的纳米粒子[32]。随CS分子质量的增大，Zeta电位增加，PDI呈先下降后上升的趋势，当CS分子质量为100 kDa时，PDI最小。因此选择100 kDa的CS用于后续CS/SBE-β-CD纳米粒子的制备，此时纳米粒子粒径较小，且Zeta电位较高（＞30 mV）。

图1 CS分子质量对CS/SBE-β-CD纳米粒子粒径、PDI和Zeta电位的影响Fig. 1 Influence of CS molecular mass on particle size, PDI and zeta potential of nanoparticles

2.1.2 CS溶液pH值对CS/SBE-β-CD纳米粒子粒径、PDI和Zeta电位的影响

从图2中可以看出，当CS溶液pH值由3.5逐渐增加到6.0时，CS/SBE-β-CD纳米粒子粒径与PDI均先减小后增加，粒径在pH 4.0时最小，PDI在pH 4.5时达最小，而CS/SBE-β-CD纳米粒子的Zeta电位则随CS溶液pH值的增加而降低。CS/SBE-β-CD纳米粒子的形成与离子间的相互作用密切相关，因此CS与SBE-β-CD的交联作用具有pH依赖性。在pH值为3.5时，强质子化作用使得溶液正电荷密度较大，分子内的静电排斥作用较强，因此CS分子链伸展，导致形成的CS/SBE-β-CD纳米粒子粒径大于pH值为4.0时的粒径。当pH值继续增大，CS溶液中带正电的—NH3+数量减少，此时溶液中CS与SBE-β-CD间的交联作用也逐渐减小，纳米粒子粒径逐渐增大。pH值超过4.0后，随pH值升高，形成的CS/SBE-β-CD纳米粒子Zeta电位快速下降，说明纳米粒子之间的静电作用力减小，致使溶液的稳定性降低从而形成沉淀。陈文彬等[33]通过研究pH值对α-生育酚-CS纳米粒子的影响也发现了类似的现象。当pH值为4.0时，CS/SBE-β-CD纳米粒子的粒径最小，且PDI较小，Zeta电位较高，说明此时纳米粒子的稳定性较高。综上，后续制备CS/SBE-β-CD纳米粒子时选择pH 4.0 CS溶液。

图2 CS溶液pH值对CS/SBE-β-CD纳米粒子粒径、PDI和Zeta电位的影响Fig. 2 Influence of pH of CS solution on particle size, PDI and zeta potential of nanoparticles

2.1.3 CS质量浓度对CS/SBE-β-CD纳米粒子粒径、PDI和Zeta电位的影响

由图3可以看出，随着CS质量浓度的增大，CS/SBE-β-CD纳米粒子的粒径和Zeta电位都逐渐增大，这是因为随CS质量浓度的增加，溶液体系中CS粒子间距减小，带正电的—NH3+数量增多，因此CS分子间静电作用力增大，进而导致CS/SBE-β-CD纳米粒子粒径增大；且溶液中带正电的粒子越多，Zeta电位越大[34-35]。当CS质量浓度为0.75 mg/mL时，CS/SBE-β-CD纳米粒子粒径和PDI均较小，Zeta电位大于30 mV，且Zeta电位大于30 mV时溶液较稳定[36]，因此选择质量浓度为0.75 mg/mL的CS溶液用于后续CS/SBE-β-CD纳米粒子的制备与分析。

图3 CS质量浓度对CS/SBE-β-CD纳米粒子粒径、PDI和Zeta电位的影响Fig. 3 Influence of CS concentration on particle size, PDI and zeta potential of nanoparticles

2.1.4 CS与SBE-β-CD质量比对CS/SBE-β-CD纳米粒子粒径、PDI和Zeta电位的影响

由图4可知，在SBE-β-CD质量一定时，随CS添加量增加，CS/SBE-β-CD纳米粒子的粒径先大幅降低后小幅增加。与CS与SBE-β-CD质量比为0.6∶1相比，CS与SBE-β-CD质量比为0.55∶1时，CS添加量过低，CS/SBE-β-CD纳米粒子易产生聚集[37-38]，因此粒径更大（664 nm）；此外，CS分子能够与SBE-β-CD发生不同程度的交联反应并导致CS/SBE-β-CD纳米粒子表面电荷密度降低，因此Zeta电位更低[39-40]。当CS与SBE-β-CD质量比为0.8∶1时，CS/SBE-β-CD纳米粒子粒径最小（245.1 nm），PDI为0.068，Zeta电位为+30.2 mV，综合考虑CS/SBE-β-CD纳米粒子粒径和Zeta电位，选择质量比为0.8∶1的条件用于后续CS/SBE-β-CD纳米粒子的制备与分析。

图4 CS/SBE-β-CD质量比对CS/SBE-β-CD纳米粒子粒径、PDI和Zeta电位的影响Fig. 4 Influence of mass ratio of CS to SBE-β-CD on particle size, PDI and zeta potential of nanoparticles

2.1.5 CS/SBE-β-CD纳米粒子TEM观察结果

从图5中可以看出，制备的CS/SBE-β-CD纳米粒子粒径分布均匀，呈现规则的圆球形，大部分CS/SBE-β-CD纳米粒子粒径在70～109 nm范围内，这与粒度仪测得的数据相比总体偏小。推测原因可能是用粒度仪测定时，样品分散在水中会有溶胀现象，而在TEM的观察中，样品是在干燥的情况下进行观察。因此通过TEM观察到的CS/SBE-β-CD纳米粒子粒径要明显小于在粒度仪中测得的粒径[41]。

图5 CS/SBE-β-CD纳米粒子的TEM图Fig. 5 TEM image of CS/SBE-β-CD nanoparticles

2.1.6 CS/SBE-β-CD纳米粒子FTIR分析结果

从图6中可以看出，CS粉末在2 878 cm-1处出现C—H伸缩振动吸收峰，1 651 cm-1处出现酰胺I带的伸缩振动峰，1 598 cm-1处N—H的弯曲振动吸收峰，1 423 cm-1处出现C—H的伸缩振动特征吸收峰，1 090 cm-1处出现—CH3的对称变形振动吸收峰。

图6 CS粉末、SBE-β-CD粉末及其混合物粉末和CS/SBE-β-CD纳米粒子的FTIR图Fig. 6 FTIR spectra of CS, SBE-β-CD, their physical mixture and CS/SBE-β-CD nanoparticles

形成CS/SBE-β-CD纳米粒子后，SBE-β-CD粉末在1 642 cm-1处的吸收峰移至1 580 cm-1处，发生了短波蓝移，CS粉末在1 156 cm-1处的吸收峰移至1 158 cm-1处，SBE-β-CD粉末在1 086 cm-1处的亚砜伸缩振动峰移至1 076 cm-1处，上述峰位置的变化都可归因于CS中的—NH3+与SBE-β-CD磺丁基阴离子之间的静电相互作用。形成CS/SBE-β-CD纳米粒子后，SBE-β-CD粉末在3 424 cm-1处吸收峰移到了3 438 cm-1处，这表明纳米粒子形成后氢键增强。CS、SBE-β-CD粉末的特征吸收峰几乎在两者物理混合物粉末中均有出现。以上结果表明，在制备CS/SBE-β-CD纳米粒子的过程中，CS带正电的—NH3+与SBE-β-CD带负电的磺丁基之间发生了静电结合，CS/SBE-β-CD纳米粒子的形成使得氢键作用增强。

2.2 CS/SBE-β-CD纳米粒子添加量对复合膜物理和机械性能的影响

2.2.1 对复合膜厚度的影响

由表1可知，空白海藻酸钠的膜厚度最大，为76.23 μm，随在CS/SBE-β-CD纳米粒子添加量从0增加到0.75 mg/mL时，复合膜厚度减小，这可能是由于CS/SBE-β-CD纳米粒子在膜基质之间的填充以及CS/SBE-β-CD纳米粒子的正电荷与海藻酸钠中的负电荷发生静电作用，形成了更为致密的结构，使得复合膜的厚度减小。当添加量为1.00 mg/mL时膜厚度增加至66.08 μm，但仍小于纯海藻酸钠膜的膜厚度，可能是随着纳米溶液添加量的继续增加，静电作用趋于饱和，而纳米粒子含量对膜厚度的影响开始显现，进而出现膜厚度开始增大的现象[41]。

表1 CS/SBE-β-CD纳米粒子质量浓度对膜性能影响Table 1 Effect of CS/SBE-β-CD nanoparticles on film properties

2.2.2 对复合膜机械性能的影响

由表1可知，随着CS/SBE-β-CD纳米粒子添加量的增加，复合膜的拉伸强度逐渐增大，当添加量为1.00 mg/mL时拉伸强度最大，为29.15 MPa，而断裂延伸率则逐渐减小，在添加量最大（1.00 mg/mL）时达到最小值，为26.43%。带有正电的CS/SBE-β-CD纳米粒子与带有负电的海藻酸钠之间通过氢键及静电相互作用而导致复合膜在微观结构上结合更加紧密，进而使得拉伸强度随纳CS/SBE-β-CD纳米粒子添加量的增加而增大；而断裂延伸率的减小则可能是由于CS/SBE-β-CD纳米粒子阻碍了海藻酸钠多糖分子的运动[42]。

2.2.3 对复合膜WVP的影响

由表1可以看出，空白海藻酸钠膜的WVP最高（0.36 g·mm/（m2·h·kPa）），复合膜的WVP会随CS/SBE-β-CD纳米粒子添加量的增加而显著逐渐减小，是因为CS/SBE-β-CD纳米粒子能够填充膜基质之间的间隙，使得膜溶液最终形成致密网络状的“弯曲路径”，从而阻止了水蒸气的渗透与扩散[43]。

3 结 论

本实验探究了CS分子质量、CS质量浓度、CS溶液pH值与CS/SBE-β-CD质量比对CS/SBE-β-CD纳米粒子粒径、PDI和Zeta电位的影响，并以此确定了制备CS/SBE-β-CD纳米粒子的最佳条件为：CS分子质量100 kDa、CS质量浓度0.75 mg/mL、CS溶液pH 4.0、CS/SBE-β-CD质量比0.8∶1。最佳条件下制备得到的CS/SBE-β-CD纳米粒子粒径为245.1 nm，PDI为0.068，Zeta电位为+30.2 mV。通过TEM观察与FTIR分析对CS/SBE-β-CD纳米粒子进行结构表征发现，制备的CS/SBE-β-CD纳米粒子呈现规则的圆球形，且CS与SBE-β-CD之间发生了静电相互作用。将制备的CS/SBE-β-CD纳米粒子用于海藻酸钠膜的改性中，与空白海藻酸钠膜相比，海藻酸钠膜中加入1.00 mg/mL CS/SBE-β-CD纳米粒子后，拉伸强度由18.18 MPa增加为29.15 MPa，MVP由0.36 g·mm/（m2·h·kPa）下降为0.21 g·mm/（m2·h·kPa），表明CS/SBE-β-CD纳米粒子添加后复合膜的物理和机械性能得到明显改善。