茄子中多种农药残留筛查能力验证

汪春明 ，张洋 ，王姝苇 ，施鹏斐 ，吴迪 ，常利民 ，杨波 ，尹峰

[中检科（北京）测试技术有限公司，北京 100123； 2.中国检验检疫科学研究院综合检测中心，北京 100123]

茄子起源于亚洲，是我国一种重要的茄果类蔬菜。我国是茄子的第一大生产国，拥有极丰富的地方品种［1］。茄子的营养价值高，食用方式多样，深受广大消费者的欢迎［2］，其质量和安全问题也备受关注。我国GB 2763—2019 《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》［3］中对果蔬中农药残留限量做了详细规定，以保障消费者的食品安全。曹哲峰［4］等对包含茄子在内的91个茄果类蔬菜样品中农药的残留情况进行检测，结果表明茄果类蔬菜总体农药残留超标情况比较严重。做好农药残留监控工作是保护人民生命安全、提高农产品质量和品牌效应、增强农产品市场竞争力的强有力保障［5］。

能力验证是利用实验室间比对，按照预先制定的准则来评价参加者的能力［6-8］，是实验室质量保证的重要手段，有助于实验室评价和证明其测量数据可靠性，发现自身存在的问题，改进实验室的技术能力和管理水平。英国分析实验能力验证公司(Food Analysis Performance Assessment Scheme，FAPAS)，是目前国际食品领域中权威的能力验证提供者，提供全球食品领域中最大、最全面的分析化学水平测试评估计划［9］。参加FAPAS能力验证并得到有效满意的结果，是判断实验室验证或校准该项目能力的标准，也是中国合格评定国家认可委员会（CNAS）判断实验室能力的重要技术依据［10］。实验室作为参加能力验证的主体，需基于自身需求和外部对能力验证的要求，在综合考虑内部质控水平、人员能力、设备状况、风险、运行成本等因素的基础上，合理策划并积极寻求适当的能力验证计划。基于自身需求，本实验室参加FAPAS 19302茄子中农药残留筛查能力验证。结合FAPAS 19302能力验证结果，对本次能力验证过程中的准备工作、样品前处理的选择与优化、定量结果的分析讨论、分析检测过程中遇到的问题及解决的思路进行总结，为食品检测实验室农药残留的检测提供参考。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

液相色谱-串联质谱仪：EXionLC-QTRAP 5500型，美国AB SCIEX公司。

气相色谱-串联质谱仪：Agilent 7890-7000型，美国安捷伦科技有限公司。

分 析 天 平：XS105型，d=0.1 mg；PL303型，d=0.001 g，瑞士梅特勒-托利多集团。

旋转蒸发仪：N1000型，日本东京理化器械株式会社。

涡旋混匀器：VORTEX GENIE 2，美国Scientific Industries公司。

振荡器：SR-2DS型，日本TAITEC公司。

超纯水系统：Milli-Q型，美国密理博公司。

氮吹仪：EVA50A型，中国普立泰科公司。

能力验证样品：FAPAS英国总部提供的茄子测试样品。

乙腈、甲酸、正己烷、丙酮、乙酸乙酯：色谱纯，美国费希尔公司。

氯化钠：分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

分散固相萃取净化管：Cleanert MAS-Q型，15 mL（300 mg C18、300 mg PSA、900 mg MgSO4），天津博纳艾杰尔科技有限公司。

氮气：体积分数为99.999%，北京东方医用气体有限公司。

氦气：体积分数为99.999%，霸州市安兴气体有限公司。

霜霉威（质量分数为97.1%）、嘧菌酯（质量分数为98.7%）、溴氰菊酯（质量分数为99.7%）、二苯胺（质量分数为99.56%）、特丁硫磷亚砜（质量分数为96.3%）：英国政府化学家实验室。

克百威（1 000 μg／mL）、胺菊酯（质量分数为99.5%）：北京曼哈格生物科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 溶液配制

胺菊酯、二苯胺和溴氰菊酯混合标准中间溶液：以丙酮为溶剂，配制成胺菊酯、二苯胺和溴氰菊酯质量浓度均为10 μg／mL和1.0 μg／mL的两种混合标准中间溶液。

嘧菌酯、克百威、霜霉威和特丁硫磷亚砜混合标准中间溶液：以乙腈为溶剂，配制成嘧菌酯、克百威、霜霉威和特丁硫磷亚砜质量浓度均为10 μg／mL和1.0 μg／mL两种混合标准中间溶液。

选择S／N＜3，且不含目标农药的样品作为空白，按照1.2.2节进行前处理制得空白样品基质溶液。

LC-MS／MS用系列标准工作溶液：分别移取1.0 μg／mL嘧菌酯、克百威、霜霉威和特丁硫磷亚砜混合标准中间溶液 10、20、50、100、200、300、400、500 μL于8只10 mL容量瓶，用乙腈定容至标线；将8份2 mL空白基质溶液氮气吹干，分别加入1 mL上述工作溶液复溶，即得到嘧菌酯、克百威、霜霉威和特丁硫磷亚砜质量浓度均分别为1、2、5、10、20、30、40、50 ng／mL 系列基质匹配标准工作溶液。

GC-MS／MS用系列标准工作溶液：分别移取1.0 μg／mL胺菊酯、二苯胺和溴氰菊酯混合标准中间溶液 50、100、200、500 μL 和 10 μg／mL 的混合标准中间溶液 100、150、200、300 μL 于 8 只 10 mL容量瓶中，由丙酮-正己烷（体积比为1∶1，下同）定容至标线；将8份10 mL空白基质溶液氮气吹干，分别加入1 mL上述工作溶液复溶，即得到胺菊酯、二苯胺和溴氰菊酯质量浓度均分别为5、10、20、50、100、150、200、300 ng／mL 系列基质匹配标准工作溶液。

1.2.2 样品制备

（1）样品粉碎。按照 GB 2763［3］的相关规定抽取有代表性的空白样品，用高速匀浆机粉碎后装入自封袋中备用。能力验证样品为FAPAS英国总部提供的茄子测试样品，冷冻（藏）包装，样品编号19032，运输到达实验室时，包装完好，样品已解冻（FAPAS作业指导书表示不影响检测）。

（2）提取。称取粉碎后的样品5.00 g（精确至0.01 g）于50 mL具塞离心管，加入20 mL酸化乙腈（乙酸体积分数为 0.5%），2.0 g NaCl，振荡 20 min，以5 000 r／min转速离心3 min，上清液转入鸡心瓶中，样品再次用20 mL酸化乙腈按上述步骤提取，合并两次上清液，于40 ℃旋转蒸发浓缩至近干，用乙腈定容至50 mL容量瓶中。

（3）浓缩、换相。LC-MS／MS：取2 mL提取液到接收管中，用40 ℃氮气浓缩至近干，用1 mL乙腈-水（3∶7）复溶，涡旋30 s，超声20 s，过0.2 μm尼龙膜，装瓶，待LC-MS／MS测定。

GC-MS／MS：取10 mL提取液到接收管中，用40 ℃氮气浓缩至近干，用1 mL丙酮-正己烷（1∶1）复溶，涡旋 30 s，超声 20 s，装入 2 mL 离心管中于 12 000 r／min 离心 3 min，装瓶，待 GC-MS／MS测定。

1.2.3 液相色谱-串联质谱条件

(1)液相色谱条件。色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm，美国沃特世公司）；柱温：40 ℃；进样体积：3.0 μL；流动相：A为0.1%甲酸溶液，B为乙腈，流量为0.3 mL／min；梯度洗脱程序：0～1.0 min为10%B，1.0～2.8 min为10%～90%B，2.8～4.8 min 为 90%B，4.8～5.3 min 为90%～10%B，5.3～6.8 min为10%B。

(2)质谱条件。电喷雾正离子模式（ESI+）；多反应监测（MRM）；气帘气：氮气，压力为0.207 MPa；碰撞气：氮气，压力为Medium；电喷雾电压：5 500 V；离子源温度：500 ℃；喷雾器压力：0.345 MPa；辅助加热器压力：0.345 MPa；驻留时：间60 ms；入口电压：10 V；各化合物监测离子对、碰撞能量见表1。

表1 种农药监测离子对及碰撞能量

1.2.4 气相色谱-串联质谱条件

（1）气相色谱条件。色谱柱：HP-5MS UI色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm，美国安捷伦科技有限公司）；进样口温度：280 ℃；进样体积：1.0 μL ；载气：氦气；质谱传输线温度：280 ℃；程序升温：60 ℃，保持1 min，以40 ℃／min升至170 ℃，再以10 ℃／min升至310 ℃，保持6 min。

（2）质谱条件。离子源为电子轰击源（EI+）；多反应监测（MRM）模式；碰撞气：氮气；离子源温度：300 ℃；各化合物监测离子对、碰撞能量见表2。

表2 种农药监测离子对及碰撞能量

2 结果与讨论

2.1 能力验证实施步骤

接收样品时需首先对样品状态进行确认，包括样品的内外包装是否完好，运输时是否符合样品的运输条件。根据作业指导书，确认样品标签与指导书编号是否相对应，样品所需的储存条件、此次能力验证的分析项及残留标示物或代谢物、推荐的检测方法、最小取样量、样品复原的方法，以及上报时的结果表示、材料要求、上报方式与时间等。

样品确认无误后进行预实验。在配制标准溶液时应双人配制，一人配制，一人监督。新配制的标准溶液可与现有的旧标准溶液在仪器上进行对比，以保证标准品浓度的准确性。选择干净无污染的实验器具，称取1份考核样品，按最低取样量取样进行实验。在前处理时可通过不同的提取、净化、浓缩方法以及不同的实验人员进行比对，通过做试剂空白、基质空白、添加定量限水平的标准品测定回收率等方法监控实验的可行性。通过在不同类型的仪器上，以及在同一类型的不同仪器上进行对比测定，保证仪器的稳定性和精密度。通过不同的定量方式，如外标法、内标法等，保证检测数据的准确性。实验过程中每一步都需有详细的实验记录。

在确定实验方法和考核样品中分析项目的浓度范围后，进行正式实验。正式实验需称取4份考核样品，其中3份为平行实验，1份为样品加标，加标量应为样品中分析项目浓度的1～1.5倍；称取3份空白样品，其中1份为基质空白，2份为空白加标，加标量与样品加标的加标量相同。如样品量充足，可重复实验2～3次，以保证实验结果的准确。实验过程也需有完整的原始记录。

整理所有的实验数据，确定上报的结果，并根据作业指导书的要求确认结果的表示与计算方法、采用的单位以及有效数字的保留位数。做好相关的记录，包括填写测试结果质量控制记录、实验记录和保存原始谱图等。

数据上报后等待结果的反馈。若反馈结果为满意，分析实验过程中的收获与不足，为下一次能力验证提供经验。若反馈结果为不合格，则需要通过翻看实验记录、原始谱图等进行全流程的原因查找，分析实验过程中存在的问题，并填写不符合工作记录、纠正措施实施计划及跟踪报告和整改报告，为下一次能力验证提供参考。

2.2 样品处理条件优化

2.2.1 检测项目盲筛

（1）农药筛选。这次FAPAS测试样品涉及到290种农药及其代谢物。本实验室现有标准品296种，但是并未完全覆盖这次FAPAS样品所涉及的290种农药及其代谢物，鉴于此，笔者只用自身现有的标准品进行筛选。

（2）样品前处理方法。

称取3.00 g样品（精确至0.01 g）于50 mL具塞离心管，加入20 mL乙腈，2.0 g NaCl，振荡20 min，5 000 r／min转速离心 3 min，上清液转入鸡心瓶中，样品再次用20 mL乙腈按上述步骤提取，合并两次上清液，将上清液于40 ℃旋转蒸发浓缩至近干，用乙腈定容至10 mL容量瓶中。

取2 mL提取液到接收管中，于40 ℃氮气浓缩至近干，用1 mL乙腈-水（3∶7）复溶，涡旋30 s，超声20 s，过0.2 μm尼龙膜装瓶，待LC-MS／MS测定筛选。

取4 mL提取液到接收管中，于40 ℃氮气浓缩至近干，用1 mL丙酮-正己烷（1∶1）复溶，涡旋30 s，超声 20 s，以 12 000 r／min 转速离心 3 min，装瓶，待GC-MS／MS测定筛选。

（3）目标农药确定。在1.2.3和1.2.4仪器工作条件下进行测定，最终确定此次的目标农药有7种，分别是霜霉威、克百威、特丁硫磷亚砜、嘧菌酯、溴氰菊酯、二苯胺、胺菊酯。

2.2.2 提取溶剂的优化

农残检测常用的提取溶剂有酸化乙腈［11-15］、乙腈［16-25］、乙酸乙酯［26］、正己烷［27-28］、丙酮［26］及其它不同比例混合提取液［29-31］。正己烷在提取非极性农药、基质简单样品时提取效率较高，本实验为茄子中多种农药残留筛查，故而排除正己烷。以空白茄子为基质，按0.1 mg／kg添加筛查出的7种混合标准溶液，比较酸化乙腈（含0.5%乙酸，体积分数）、乙腈、丙酮-正己烷（1∶1）、乙酸乙酯、丙酮5种提取溶剂对回收率的影响。

分别称取15份各5.0 g茄子于50 mL具塞离心管，分别加入20 mL 5种不同的提取溶剂（酸化乙腈（含0.5%乙酸，体积分数）、乙腈、丙酮-正己烷（1∶1）、乙酸乙酯、丙酮，每种提取溶剂作3个平行样，一共15份），分别加入2.0 g NaCl，振荡20 min，以5 000 r／min离心3 min，上清液转入鸡心瓶中，样品再次用20 mL乙腈按上述步骤提取，合并两次上清液，将上清液于40 ℃旋转蒸发浓缩至近干，分别用对应的5种提取溶剂定容至50 mL容量瓶。然后按1.2.2（3）进行操作。

其中以丙酮作为提取溶剂，合并两次上清液后不能旋蒸至干，笔者认为足量的丙酮能使茄子中蛋白、脂质类成分溶解出来，而这些成分又不易挥发，干扰后期检测，故而舍弃丙酮作为提取溶剂。其余4种提取溶剂的回收率见图1。

图1 不同提取溶剂下目标农药的回收率

由图1可知，当用正己烷-丙酮、乙酸乙酯作为提取溶剂时，霜霉威的回收率只有5.4%和9.8%；当用乙酸乙酯提取时，溴氰菊酯的回收率为145%，回收率偏高；以乙腈和酸化乙腈作为提取溶剂时，回收率都能满足方法验证学要求。综合考虑，选择酸化乙腈作为提取溶剂。

2.2.3 基质效应

基体通常会对目标物的分析产生较为明显的干扰，并影响分析结果的准确性，这些干扰或影响被称为基质效应［32］。基质效应的强弱与被研究基体种类有关，不同农药在不同基质中，产生的基质效应不同；基质效应还与被分析物本身的结构、浓度等理化性质相关；外部环境如分析过程中使用的缓冲溶液、试剂、前处理方法等也会对基质效应产生影响［33］。因此有必要对基质效应进行评价。分别绘制溶剂标准曲线和基质匹配标准曲线，用以评价方法的基质效应，基质效应系数η=（基质匹配标准曲线的斜率-溶剂标准曲线的斜率）／溶剂标准曲线的斜率。当|η|＜10%时，表明无明显的基质效应；反之，则具有明显的基质增强或减弱效应［34］。分别按1.2.3和1.2.4仪器条件测定1.2.1配制的系列标准工作溶液，得到的拟合线性方程见表3。

表3 线性方程与基质效应

由表3可知，胺菊酯、溴氰菊酯、克百威的基质效应系数分别为55.9%、59.9%、-34.5%，有明显的基质效应，因此采用基质匹配线性方程对胺菊酯、溴氰菊酯、克百威进行定量分析。

2.2.4 净化方式

基于QuEChERS原则［35］的经典样品处理方法，已被广泛应用于农药多残留、兽药多残留、生物毒素、非法添加及其它有毒有害污染物检测。结合待研究基质简单的特点，本研究对基于QuEChERS原则的样品处理方法进行考察，常用的净化填料有硅胶键和碳十八（C18）、N-丙基乙二胺（PSA）、石墨化碳黑（GCB）、NaCl盐析、无水MgSO4除水。其中C18去除脂肪和脂类等非极性干扰物；PSA主要用来净化各种有机酸、金属离子、色素以及一些糖类、酚类和脂肪酸；GCB去除色素、甾醇类非极性干扰物。GCB本身独特的平面结构可与色素发生不可逆吸附，与此同时GCB会对某些平面结构的农药像嘧菌环胺、多菌灵、吡嗪酮、噻菌灵、百菌清和蝇毒磷造成25%左右的损失。由于茄子样品色素含量较少，故排除GCB。

样品按1.2.2（2）提取，取12 mL提取液至15 mL Cleanert MAS-Q净化管中，振荡5 min使净化完全，以5 000 r／min离心 5 min，之后按1.2.2（3）进行处理，然后按1.2.3、1.2.4测定，结果见表4。

Cleanert MAS-Q净化管只含有300 mg PSA、300 mg C18和 900 mg MgSO4。MgSO4只除水分，对目标化合物的影响不大，故再考察PSA和C18对7种目标化合物的影响。分别用PSA和C18进行净化后测定，结果见表4。

表4 不同净化方式和净化填料对回收率的影响（n=3）

由表4可知，经过QuEChERS填料净化之后，霜霉威回收率为37.3%，二苯胺回收率为78.1%；在没有基质干扰的情况下，经过PSA净化的目标化合物回收率为67.6%～94.9%；经过C18净化的回收率为31.9%～99.7%，其中霜霉威、溴氰菊酯、胺菊酯的回收分别为31.9%、41.1%和43.7%，无法满足方法验证学要求。

样品经过净化，影响了目标化合物的回收，综合以上实验结果和茄子基质较为简单的特点，故本实验采用直接提取、不净化的方式。

2.3 样品测定结果

按1.2.2、1.2.3和1.2.4节进行样品前处理和仪器测定，一共测定3次，每次3个平行，得到的数据见表5。

由表5可知：（1）腈嘧菌酯（嘧菌酯）、克百威、霜霉威和特丁硫磷亚砜3次测定结果较为接近，且每次测定结果的相对标准偏差小于5.2%，结果稳定可靠。通过3次测定结果与3次测定结果的平均值对比发现，第3次的测定结果更加接近3次测定结果的平均值，故选择第3次作为上报数值。

表5 能力验证样品测定结果

（2）胺菊酯、二苯胺和溴氰菊酯3次测定结果相差较大，且相对标准偏差在6.9%～29.5%之间。结合GC-MS／MS一批序列中同一样品测定结果越来越低的异常现象，决定不予上报。另外，让人费解的现象是两台GC-MS／MS多次运行同一样品，得到的结果都呈下降的趋势。由此带来两个问题：（1）平行测定数据相差大，笔者分取15份5 mL空白样品，分别加入50 μL 1.0 μg／mL混合标准溶液，在40 ℃下氮气吹至近干，分别由1 mL正己烷（3份）、丙酮（3份）、乙腈（3份）、正己烷-丙酮（1∶1）（3份）、乙酸乙酯（3份）复溶，用GC-MS／MS测定并计算回收率。由结果可知，不同复溶溶剂对平行测定数值的影响不大，其中乙腈复溶的回收率及平行性略好于其它复溶溶剂，乙腈归为极性溶剂，对本次所用的非极性色谱柱不友好。（2）仪器测定数值下降，仪器粗略可分为进样系统、分离系统、质谱部分。仪器自动调谐，调谐参数显示仪器正常；更换全新色谱柱，下降现象依然存在；清洗进样口，更换衬管，平行测定数据趋于稳定。后期进一步实验、分析，认为不管是每次的平行之间，还是这3次测定结果之间，测定结果相差较大的原因是“衬管”没有达到质量要求。

2.4 数值对比

根据FAPAS公布的此次能力验证的结果显示，样品19032茄子中多种农药残留筛查中，腈嘧菌酯(嘧菌酯)、克百威、霜霉威和特丁硫磷亚砜的通过率分别为98%、95%、85%和83%，笔者上报数值与FAPAS赋值基本接近，见表6，Z值在0.3～0.6之间，本次比对结果为“满意”。

表6 FAPAS赋值、上报值及能力验证结果（Z值）

3 结论

此次FAPAS能力验证的难点在于农药涵盖的范围广、数量多，一般实验室难以具备如此数量的标准品储备。好在FAPAS不强制性要求参试机构把所有的农药项目都一一检测出来，并准确赋值。参试实验室只需检测自身能力范围内、FAPAS供试样品所含农药，且上报数值位于整体上报数值的合理范围内，即可以通过此次能力验证。

茄子中的农药经过0.5%乙酸乙腈提取，分取提取液后浓缩，换相，上机检测，结果的Z值在0.3～0.6之间，评价结果为“满意”。

通过参加FAPAS茄子中多种农药残留筛查能力验证所做的准备工作、基本分析流程和关键操作方法技巧，分析检测过程中遇到的问题及解决问题的思路，为其它实验室参加诸如FAPAS农药残留能力验证工作提供经验参考。