浸种剂对水稻种子微生物群落结构的影响

刘元辉 徐春梅 陈松 褚光 章秀福 王丹英

（中国水稻研究所，杭州 310006；第一作者：liuyuanhui@caas.cn；*通讯作者：wangdanying@caas.cn）

水稻是世界上主要的农作物之一，近一半人口以稻米为主食，其产量在维持全球粮食供应方面起着核心作用[1]。目前，全球环境恶化及气候变化等各种因素均增加了水稻病虫害发生，威胁着全球粮食安全[2]。利用杀菌剂和杀虫剂进行种子处理，实现水稻早期病虫害防治，对于减少农药使用量、保障水稻产量具有重要意义。种子处理是利用物理、化学和生物的方法和手段，主要包括浸种、拌种、种子包衣和种子丸粒化等，为农作物种子提供保护，促进种子健康出苗。我国从20世纪50 年代就开始通过药剂浸种、拌种来防治农作物种传病害[3-4]。咪酰胺为咪唑类广谱杀菌剂，是一种高效、广谱、低毒型杀菌剂，具有预防、保护、治疗等多重作用；无内吸作用，主要通过抑制麦角甾醇生物合成而起作用，对于子囊菌和半知菌引起的多种病害防效极佳。咪酰胺是水稻生产中常用的浸种剂，对水稻恶苗病、稻瘟病、纹枯病等具有良好的防治效果[5]。与此同时，有研究发现，咪酰胺浸种对水稻种子萌发及幼苗生长有抑制作用[6]。那么，咪酰胺在抑制种子表面病原菌生长传播的同时是否也抑制种子内部有益微生物生长？

目前，浸种剂的研究主要集中于对水稻种传病害的防治、种子萌发和幼苗生长等方面，其对水稻种子内生微生物群落结构的影响尚不清楚。因此，本研究利用高通量测序技术和微生物分离培养，分析了咪酰胺浸种对水稻种子表面真菌和内生细菌群落结构的影响，以期为咪酰胺在水稻上的安全利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试水稻品种为秀水134；供试药剂为25%咪酰胺，江苏辉丰生物农业股份有限公司生产。

1.2 试验设计

试验共设清水浸种（CK）和咪酰胺浸种（Soak）两个处理，每个处理5 次重复。选取0.5 g 均匀完整的水稻种子，用2 mL 0.1% 咪酰胺浸泡种子36 h，然后用无菌去离子水洗掉表面残余咪酰胺，加入30 mL 10 mM MgCl2超声震荡3 h，吸取 1 mL 上述浸提液，依次以10倍稀释梯度稀释，取10-2~10-4浓度的菌悬液100 μL 涂布于孟加拉红培养基，每个浓度涂5 个培养皿，28℃培养，每隔24 h 观察1 次，选取合适的稀释浓度统计培养皿上的菌落数以验证浸种剂对水稻表面真菌的影响。CK 用相同体积去离子水浸泡种子。为了研究浸种处理对水稻种子内生细菌的影响，首先对种子进行表面消毒，然后按照上述方法进行咪酰胺浸种和清水浸种，提取不同处理的种子DNA，并进行16S rRNA 基因扩增子测序及分析。

1.3 测定项目及方法

1.3.1 水稻表面真菌菌落计数

统计种子表面菌悬液在孟加拉红培养基上长出的单菌落数目，计算平均每1 g 种子表面真菌数目。真菌数目=（真菌数目×稀释倍数）/种子质量。

1.3.2 种子表面消毒方法

挑取0.5 g 均匀完整的水稻种子，用灭菌的去离子水清洗 2 次；75% 乙醇 2 min；表面消毒液（20% 次氯酸钠、3% 氯化钠、0.1% 碳酸钠、0.15% 氢氧化钠混合液）摇床（150 rpm 摇 12 min），倒掉液体；75% 乙醇 30 s，生理盐水洗涤7 次。为了排除种子表面微生物，将最后一遍的清洗液吸取100 μL 涂布在TSA 培养基上培养。

1.3.3 DNA 提取，16S rRNA 基因扩增子测序及分析

各个处理的种子转移至无菌研钵中，用无菌的1 mL 10 mM MgCl2溶液磨碎。种子匀浆按照Mabio 植物DNA 小量提取试剂盒B 所示方法提取每个样品的基因组DNA，使用NanoDrop ND-1000 UV-Vis 分光光度计测定DNA 的浓度和纯度。引物515 F（5‘-GTG CCA GCM GCC GCG GTA A-3’） 和 806 R（5‘-GGACTA CVS GGG TAT CTA AT-3’） 被用于扩增细菌 16S rRNA 基因的可变 V4 区。PCR 条件如下：94℃，5 min；94℃，30 s；52℃，30 s；72℃，30 s；72℃，10 min，30 个循环。使用Illumina 的NEBNext®UltraTMDNA 文库制备试剂盒构建测序文库并添加index codes。使用Qubit @2.0 荧光计和Agilent Bioanalyzer 2100 系统对文库质量进行评估。在Illumina_Hiseq 2500 平台上对该文库进行测序，并生成了长度为250 bp 的配对末端读段。使用USEARCH v.11.06[7]对序列进行合并，修剪，过滤，比对和聚类后得到操作分类单位（OTU）。通过USEARCH 中的UPARSE-OTU 算法将具有≥97%相似性的序列分配给同一OTU。并使用VSEARCH 2.11[8]进行嵌合体检测后去除。

1.4 统计分析

使用R 中的phyloseq 软件包（版本3.6.0）通过负二项式模型对生成的OTU 表进行标准化。主坐标分析是利用Bray-Curtis 距离评估处理之间微生物群落的差异。为了计算β 多样性的显著性，在vegan 中使用函数adonis 进行了置换多变量方差分析（PERMANOVA）。Shannon、Chao 1 和 Fisher 指数以及观察到的物种数量是使用R 包vegan 中的功能多样性计算的，并进行了Kruskal-Wallis 检验以评估处理之间的差异。采用R 包 agricolae 进行 Fisher 最低显着性（LSD）检验（p<0.05）。本研究中的所有数据均使用R 中ggplot2 和OriginPro 2017 生成。

2 结果与分析

2.1 咪酰胺浸种对种子表面真菌的影响

选取稀释倍数为1 000 倍平板统计，结果（图1）发现，与CK 相比，Soak 处理下水稻种子表面真菌的菌落数显著降低，表明用咪酰胺浸种显著抑制了水稻种子表面真菌的生长。

2.2 咪酰胺浸种对种子内细菌群落多样性的影响

为了确定咪酰胺浸种是否影响水稻种子内生细菌群落结构，提取不同处理种子DNA，并使用16S rRNA基因的扩增子测序来研究微生物群落特征。经过质量过滤和嵌合体去除后，从10 个样品中获得537 146 个序列（平均每个样品53 715 个），并以97%的序列相似性鉴定出1 646 个微生物OTU。使用Shannon、Chao1和Fisher 指数以及观察到的OTU（丰富度）数量来评估微生物群落α 多样性。结果发现，CK 种子内细菌群落α 多样性略高于Soak 处理，但差异不显著（图2）。基于Bray-Curtis 距离对种子内细菌群落进行主坐标分析 （PCoA）和置换多变量方差分析（PERMANOVA），从图3 可见，CK 和Soak 处理下水稻种子内细菌群落 β 多样性差异不明显（R2=12.54%，p=0.229）。

2.3 咪酰胺浸种对种子内细菌群落组成的影响

分类学分析Soak 处理和CK 水稻种子内占主导地位的细菌相对丰度的差异。如图4 所示，在门分类水平下，相对丰度前20 的门在CK 和Soak 处理之间没有显著差异。其中，变形菌门（Proteobacteria）的相对丰度在Soak 处理和CK 分别占水稻种子内细菌群落71.36%和70.75%；放线菌门（Actinobacteria）的相对丰度分别占17.78% 和 20.10%；拟杆菌门（Bacteroidetes）的相对丰度分别占3.17% 和3.02%。在属分类水平下，部分属的相对丰度在Soak 处理的水稻种子内细菌群落占比更高，但是差异不显著。比如黄单胞菌属（Xanthomonas）的相对丰度在Soak 处理和CK 分别占9.63%和9.23%；假单胞菌属（Pseudomonas）的相对丰度分别占8.70%和5.82%；甲基杆菌属（Methylobacterium）的相对丰度分别占8.54%和5.83%。同时，也有一些属的相对丰度在CK 的水稻种子内细菌群落占比更高，差异不显著。比如根瘤菌属（Rhizobium）的相对丰度在Soak 处理和CK 下分别占水稻种子内细菌群落17.24%和 22.12%；泛菌属（Pantoea） 的相对丰度分别占11.16%和 11.65%；细杆菌属（Microbacterium）的相对丰度分别占8.51%和12.04%。

3 讨论与结论

咪酰胺浸种通过抑制种子表面真菌的生长从而实现防治种传病害的目的，它对水稻恶苗病、稻曲病均有较好的防治效果[5，9-10]。况卫刚等[11]采用菌株分离方法证实了咪酰胺对青稞种子携带真菌具有显著抑制作用和消毒效果。这与本研究结果相吻合，咪酰胺浸种降低了水稻种子表面真菌数目。然而，咪酰胺浸种是一把双刃剑，邓接楼等[6]发现，咪酰胺浸种降低了杂交水稻种子的发芽率和发芽指数，并抑制了幼苗生长。目前，咪酰胺浸种剂对种子内细菌群落的多样性及组成的研究较少。国际种子卫生联合会建立了一系列以种传病原菌数量来评估种子质量和纯度的标准，各种植物检疫措施，包括机械、热、物理、生物和化学清洗种子的方法被广泛使用[12]。并且，通常研究特定植物与微生物的相互作用时对种子进行了表面消毒，以及分离培养种子微生物的挑战导致科学家们长期认为种子内是无菌的，萌发期幼苗的微生物主要来源于周围环境，特别是土壤[13]。本研究利用16S rRNA 扩增子测序技术分析种子内细菌群落结构，结果发现，咪酰胺浸种处理对水稻种子内部细菌群落多样性及优势菌群比例没有显著影响。本试验结果表明，咪酰胺浸种剂在抑制种子表面真菌的同时没有影响内部细菌群落，包括种子内对植物生长有益的细菌群落。这为我们科学合理使用咪酰胺浸种防治水稻病害提供了理论依据。