黑木耳乙醇提取工艺优化与醇提物体外抗氧化活性分析

2021-12-02周天天陈喜君梁继国曲啸婷赵文文孔祥辉

食药用菌 2021年6期

周天天陈喜君梁继国曲啸婷赵文文孔祥辉*

（1.黑龙江省科学院微生物研究所，哈尔滨 150000；2.黑龙江省菌物药工程技术研究中心，哈尔滨 150000；3.黑龙江众生生物工程有限公司，哈尔滨 150023；4.吉林省辉南国有林保护中心，吉林通化 135199；5.哈尔滨商业大学，哈尔滨 150000；6.黑龙江省黑木耳资源利用工程技术研究中心，哈尔滨 150000）

黑木耳（Auricularia auricula）营养丰富、食药兼用。据《本草纲目》记载，木耳入胃、大肠经，可“益气不饥，轻身强志” “利五脏，排毒气”[1]。黑木耳富含铁、钙和多种氨基酸，是天然补血品[2]，具有抗血小板聚集、抗血栓、提高免疫、减轻动脉硬化、延缓衰老[3]、抗辐射、抗炎、降血糖、抗癌、抗突变、抗菌、清胃涤肠、化解胆结石和肾结石、润滑肠道等广泛药理活性[4]。其在大健康产业中具有良好的市场应用前景。

近年来，针对黑木耳的研究主要集中于子实体或菌丝体活性成分提取、保健作用及产品开发方面，尤其是防治高血脂和冠心病作用等[5-7]。对活性成分的提取研究主要针对木耳水提工艺及其活性成分[8,9]，而对醇提物的相关研究较少[10,11]。醇提物具有的活血化淤等作用[12,13]，可作为抗血栓保健食品和药材的筛选来源。研究显示，黑木耳醇提物具有较强的DPPH 自由基清除活性，且与浓度呈正相关[14]。但目前仍然存在提取率低、提取条件复杂及活性成分不明确等问题。因此，开展黑木耳醇提取工艺及其成分研究具有重要意义。

本文从木耳粉碎粒度、乙醇浓度、料液比、超声功率及超声时间等方面对黑木耳醇提物的提取条件进行优化，通过单因素试验确定影响提取得率的主要因素，通过正交试验确定最优条件，并对醇提物的脂肪、多酚等活性成分进行检测和抗氧化活性研究，为相关产品开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

黑木耳样品来源于黑龙江省绿山农业开发有限公司黑木耳栽培基地，菌种由黑龙江省科学院微生物研究所提供。分析纯试剂葡萄糖、无水乙醇、乙醚、牛血清蛋白、磷酸、浓硫酸为天津市永大化学试剂有限公司生产；考马斯亮蓝G-250、重蒸酚来自上海化学试剂采购供应站试剂厂。

1.2 试验设备

中草药粉碎机TAISITE（天津市泰斯特仪器有限公司），电子分析天平JB5374-91（奥豪斯国际贸易上海有限公司），超声波发生器SL-SM300（南京顺流仪器有限公司），紫外可见分光光度计UV757CRT（上海仪电分析仪器有限公司）；电热恒温水浴锅HWS24 型、离心机TGL20M-Ⅱ、电热鼓风干燥箱BPG-9040A 均为上海一恒科技有限公司生产。

1.3 试验方法

（1）黑木耳醇提物的制备流程。将木耳用中药粉碎机粉碎，过筛成不同粒度，备用。称取5 g（精确至0.0001 g）木耳粉装入烧杯，加入一定量乙醇溶液，振荡摇匀。60 ℃恒温水浴锅中加热，超声波提取[10]1 h。7 500 r/min 离心20 min，分离出上清液用旋转蒸发仪浓缩后于干燥箱（60 ℃）干燥至恒重。用差值法计算醇提物质量，用比值法计算醇提物得率。

（2）黑木耳粉粒度对醇提物得率的影响。称取5 g 不同粒度木耳粉（60 目、80 目、100 目、120目和140 目），以料液比（W/V）1∶20 加入100 mL 90%乙醇溶液，60 ℃恒温水浴提取1 h，入超声波仪，超声功率480 W 提取20 min，7 500 r/min 离心20 min，其他处理同1.3（1），3 次平行实验。

（3）乙醇浓度对醇提物得率的影响。称取5 g 100 目木耳粉，分别加入50%、60%、70%、80%、90%和100%的乙醇溶液100 mL，水浴提取、超声波提取及其他处理同1.3（1）。3 次平行实验。

（4）料液比对醇提物得率的影响。称取5 g 100目木耳粉，分别加入90%乙醇溶液，料液比（W/V）分别为1∶10、1∶15、1∶20、1∶25 和1∶30，水浴提取、超声波提取及其他处理同1.3（1）。3次平行实验。

（5）超声功率对醇提物得率的影响。称取5 g 100 目木耳粉，按照1∶25 的料液比加入90%乙醇溶液，水浴提取及其他处理同1.3（1）。超声波提取时间为20 min，超声功率分别为360 W、720 W、1 080 W、1 440 W 和1 800 W。3 次平行实验。

（6）超声时间对醇提物得率的影响。称取5 g 100 目木耳粉，按照1∶25 的料液比加入90%的乙醇溶液，水浴提取及其他处理同1.3（1）。超声提取功率1 440 W，超声时间分别为10 min、20 min、30 min、40 min 和50 min。3 次平行实验。

（7）黑木耳醇提物制备的最优条件。采用L9（34）正交试验法对影响黑木耳醇提物得率的主要因素进行研究和分析。根据单因素试验结果，确定正交试验因素和水平（表1）。

表1 L9（34）正交试验的因素和水平

（8）黑木耳醇提物的粗脂肪含量测定。称取5.00 g 样品，置于蒸发皿中，加入20 g 石英砂，以沸水浴蒸干，在100±5 ℃下干燥、研细。蒸发皿及附有样品的玻璃棒用沾有乙醚的脱脂棉擦净，一并转入具塞锥形瓶中，加乙醚至完全浸没样品并多加20～30 mL，浸泡过夜（12 h 以上），用G3 垂融漏斗过滤于已恒重的脂肪烧瓶中，并分次加入乙醚，用力振摇后一并滤入脂肪瓶中，洗涤3 次，水浴回收溶剂，蒸干后95～105 ℃干燥2 h 称重，计算样品中脂肪含量[18]。

（9）黑木耳醇提物的多酚含量测定。配制酒石酸亚铁溶液：称取1 g 硫酸亚铁和5 g 酒石酸钾钠，用水溶解并定容至1 L（避光低温保存）。准确吸取试液1 mL，注入25 mL 容量瓶中，加水4 mL和酒石酸亚铁溶液5 mL，充分混匀，再加入pH 7.5磷酸盐缓冲液至刻度，在波长540 nm 处，以试剂空白溶液作对照测吸光度[19]。计算公式为：

式中：L1 为试液总量（mL），L2 为测定时的用液量（mL），M为试样的质量（g），m为试样干物质含量百分数（%），A为吸光度。

（10）抗氧化活性分析。参考林恋竹[23]和Shimadak[24]的方法，用维生素C（VC）作阳性对照，判断各种浓度的黑木耳醇提物清除DPPH·的能力。试验方法：A0试管为2 mL 蒸馏水+2 mL 0.2 mmol/L 的DPPH·-无水乙醇溶液；Ai试管为2 mL不同浓度的黑木耳醇提物样品溶液+2 mL 0.2 mmol/L 的DPPH·-无水乙醇溶液；Aj试管为2 mL不同浓度的黑木耳醇提物样品溶液+2 mL 无水乙醇溶液。黑木耳醇提物溶液、VC溶液对DPPH·清除率的计算公式如下：

式中：A0为不加黑木耳醇提物溶液的吸光度值；Ai为加入黑木耳醇提物溶液和DPPH·-无水乙醇溶液的吸光度值；Aj为加入黑木耳醇提物溶液和无水乙醇的吸光度值。

2 结果与讨论

2.1 黑木耳醇提取最优条件的确定

（1）黑木耳粉碎粒度对醇提物得率的影响。木耳粉碎粒度是影响黑木耳醇提物得率的一个主要因素，在料液比1∶20、乙醇浓度90%、超声功率480 W、超声时间20 min 条件下，随着木耳粒度的减小，黑木耳醇提物得率呈先增后减的趋势（图1-A），在粒度为100目时得率最高，达4.59%。出现这一趋势的原因可能是在一定范围内，粒度越小越利于醇溶物质充分溶于乙醇中，但当达到一定临界时，粒度过小可能会破坏一些成分，导致溶于乙醇的物质含量减少。因而，确定粒度100 目为最佳。

图1 黑木耳粉粒度、乙醇浓度、料液比、超声功率和超声时间与醇提物得率的关系

（2）乙醇浓度对醇提物得率的影响。随着乙醇浓度的增加，黑木耳醇提物得率呈现出先增加后减少的趋势（图1-B），当乙醇浓度为90%时，醇提物得率最高，为4.38%，其后降低。表明90%浓度范围内，乙醇浓度越高越有利于黑木耳醇溶性成分溶出。

（3）料液比对醇提物得率的影响。随着乙醇体积的不断增加，黑木耳醇提物得率呈现先增加后减少的趋势（图1-C），当料液比为1∶25 时，醇提物得率最大，达4.71%。表明料液比1∶25 范围内乙醇溶液体积越大越有利于黑木耳醇溶物溶出。

（4）超声功率对醇提物得率的影响。随着超声功率的增大，黑木耳醇提物得率呈现先增加后趋平稳的状态（图1-D），当超声功率为1 440 W 时，醇提物得率最大，达4.36%。表明，超声功率越大，其振荡效果越好，可促进黑木耳中醇溶物溶出，但当达到一定功率时，醇溶物溶出率不再增加。

（5）超声时间对醇提物得率的影响。随着超声时间的增加，黑木耳醇提物得率呈现先增加后减小的趋势（图1-E），当超声时间为30 min 时，黑木耳醇提物得率最大，为4.33%。表明一定时间内超声时间的增加有利于黑木耳中的醇溶物溶出，但当达到一定临界后，可能由于超声时间延长会破坏醇溶物中的某些成分，导致得率降低。

（6）黑木耳醇提物的正交分析结果。根据单因素试验的结果确定影响黑木耳醇提物得率的主要因素是乙醇浓度（A）、料液比（B）和超声时间（C）。采用L9（34）正交试验法[20]对上述3 个因素进行研究和分析，确定黑木耳醇提物的最优条件，如表2所示。

由表2中的R 值可知，本试验所研究的3 个因素对黑木耳醇提物得率影响的主次顺序为B（料液比）＞A（乙醇浓度）＞C（超声时间）。正交试验直观结果表明，最佳方案为A2B3C1，即乙醇浓度为90%，料液比为1∶30，超声时间为20 min。由极差分析得到的最佳方案为A2B3C2，即乙醇浓度为90%，料液比为1∶30，超声时间为30 min。