应激和细胞凋亡对马精液功能和保存的影响

张峰瑞，王缘梅，葛慧琳

（1.四川农业大学生命科学学院，四川雅安 625099；2.家蚕基因组生物学国家重点实验室（西南大学），重庆市 400715；3.北京大学物理学院，北京市 100091）

虽然过去几年在液体或冷冻储存马精子方面取得了相当大的进展，但种马精液保存情况仍存在很大的个体差异。在低温贮藏过程中，马精子受到膜磷脂、蛋白质和染色质的氧化损伤。渗透胁迫可导致细胞膜的损伤和精子代谢的改变。此外，来自许多物种的证据也表明，精子在冷冻保存过程中会发生类似凋亡的变化。这3个过程似乎是相互联系的，可能通过类似的途径影响精子细胞的功能（段洪云等，2012）。因此，了解这些过程及其共同的代谢途径对保存马精子有重要意义。

1 氧化应激

氧化应激是许多疾病过程的一个明确的组成部分。活性氧的产生可能是氧化代谢的正常结果，也可能是特定细胞类型的特定机制，如白细胞氧化。氧化应激是影响精子功能的重要因素。活性氧在正常精子功能中起重要作用，活性氧的产生或降解不平衡可能对精子产生严重的影响。在精子储存过程中，氧化应激的影响尤为重要，当精液样本中大量的精浆被移除时，这种损害会进一步加剧，因为精液中的大量抗氧化能力与精浆共存（赵宪林等，2010）。

1.1 马精液活性氧清除精液中主要活性氧清除酶为过氧化氢酶、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶，这些清除酶在精液中的相对数量和重要性似乎存在很大的物种差异，Baumber和Ball（2005）测定了这些酶系统对马精液的相对活性，过氧化氢酶为（8.7±29.2）U/mg、超氧化物 歧 化 酶 为（29.15±6.64）U/mg、（0.87±0.06）μmol NADPH氧化/（min/mg）。前列腺组织匀浆过氧化氢酶的比活性明显大于壶腹部、球尾腺、泡状腺、附睾尾液或睾丸，这些数据表明，马精浆具有相对较高的过氧化氢酶和超氧化物歧化酶活性，这些清道夫的活性在种马之间存在显著差异。精子中活性氧清除剂的数量似乎非常有限，而精浆是活性氧清除剂的一个有效来源，其作用是保护精子免受活性氧的不利影响。在精子保存过程中去除精浆可能会增加精子对氧化应激的敏感性。除了上述提到的酶清除剂外，精浆中的许多其他成分也可能抵消纯精液中的氧化应激，特别是白蛋白、尿酸、牛磺酸、次牛磺酸、丙酮酸、乳酸、抗坏血酸、生育酚和麦角硫氨酸等。虽然对马精浆成分及马精液中低分子量抗氧化剂作用的研究相对较少，但对精浆总抗氧化能力的评估表明，这些低分子量成分可能构成了精液的大部分抗氧化能力（Thiele等，2015）。

1.2 活性氧的产生马精子产生活性氧似乎来自于精子头部质膜中存在的一种精子特异性NADPH氧化酶或来自精子线粒体（Sabeur和Ball，2007）。虽然超氧化物阴离子是马精子生成的主要活性氧，这种短暂的形式迅速歧化形成过氧化氢，其是精子主要的细胞毒性物质。低温损伤、不可存活或形态异常的精子，特别是以近端细胞质液滴或中段异常为特征的精子，会显著增加活性氧的产生（Sabeur和Ball，2007）。在这些条件下，大量活性氧主要是由线粒体电子传递链的电子泄漏和随后分子氧的还原形成超氧阴离子驱动的（Sabeur和Ball，2007）。

1.3 活性氧对精子功能的影响在生理条件下，钙会刺激生成较少的活性氧，而膜相关的NADPH氧化酶似乎是导致活性氧生成的可能机制。在冷冻保存过程中，精子细胞内钙离子浓度增加，活性氧生成增加，由于精浆抗氧化能力降低，可能导致精子过早获能（Neild等，2005），进而导致冷冻保存的精子寿命缩短。

虽然超氧阴离子是精子产生的主要产物，是对马精子损伤最重要的活性氧（Neild等，2005）。当马精子暴露于外源性活性氧时，过氧化氢的产生增加，精子活力下降。添加活性氧酶清除剂来评估超氧阴离子和过氧化氢的相对重要性，如过氧化氢酶分解过氧化氢，而超氧化物歧化酶分解超氧阴离子，在诱导的氧化应激下可以维持精子正常的运动。因此，精子活力似乎是氧化应激的一个敏感指标，可能是氧化应激过程中最先受到影响的参数之一。

1.4 活性氧对精子DNA完整性和膜脂氧化的影响活性氧是造成包括精子在内的多种细胞DNA损伤的原因之一。在马精子中，活性氧浓度增加，DNA损伤呈剂量依赖性增加。过氧化氢酶或还原性谷胱甘肽存在时，DNA损伤被阻断，这表明过氧化氢是导致马精子DNA损伤的主要活性氧（Baumber等，2005）。较少的氧化应激可能会增强精子的获能能力，从而增强精子的受精能力。因此，较少的氧化应激可能使DNA受损的精子与卵母细胞受精。精子细胞局限于没有能力修复DNA损伤，尽管可能发生受精，但也会影响后续的胚胎发育，增加早期胚胎的死亡速度（Morris等，2007）。

精子膜具有相对高浓度的多不饱和脂肪酸，容易受到过氧化损伤。由于过氧化氢和氧负离子的能量不足以引发脂质过氧化反应，因此，通常需要过渡金属催化剂来引起脂质过氧化反应（Ball和Vo，2002）。过渡金属催化剂（如Fe2+）的存在可引发脂质过氧化，脂质过氧化与脂质过氧化物的形成发生链式反应，最终形成细胞毒性醛，包括丙二醛和更强的4-羟基壬烯醇（Ball和Vo，2002）。膜脂过氧化改变了精子的膜流动性，这种改变会影响精子膜的融合能力，它是精子顶体胞吐的一个重要功能。虽然哺乳动物精子的脂质过氧化特征明显，但马精子相对于其他家畜精子表现出更强的抗膜过氧化能力（Neild等，2005）。但低温保存增加了马精子对脂质过氧化的敏感性，这种敏感性在精子中段区域更为明显。Ball和Vo（2002）报道，在5℃下储存液体精液会导致马精子的脂质过氧化增加。

2 渗透压应激

2.1 渗透压应激对精子功能的影响渗透应激是精子冷冻保存过程中损伤的重要因素之一，由于水和溶质在精子质膜上的移动导致细胞体积变化所引起的渗透应激是精子损伤的一个重要特征。马精子表现为线性渗透，当精子膨胀或收缩超过相当窄的渗透耐受范围时细胞就会死亡发生（Ball和Vo，2002）。添加甘油或其他可渗透的冷冻保护剂作为大多数冷冻保存介质的一部分，在冷冻保护剂通过精子膜达到平衡前会导致渗透压瞬间增加，当细胞外的介质在冷却过程中冻结时，水的冻结使精子悬浮在的介质中，由于未冻结的水中溶质浓度增加，这些介质的渗透压越来越高。甘油和水渗透率的差异及这些渗透率对温度的依赖关系似乎是渗透应激的重要组成部分（Pommer等，2002）。当甘油含量高的细胞突然转移到等渗、不含甘油的培养基时，细胞内环境相对于细胞外环境是高渗的。因为甘油的通透性比水的通透性小，所以在相对低渗透的条件下会有水的净流入，从而导致细胞体积增加。如果细胞体积的变化超过其渗透耐受性，可能导致细胞裂解。如果精子受到渗透应激，并在＞0℃的温度下受到冷休克，这些因素可能导致精子膜功能改变，这在冷冻和解冻过程中对精子有害。特别是渗透和冷休克对精子共同作用可导致精子膜的水输运减少，而水运输对整个精子膜在冻融精子生存方面具有重要作用（Devireddy等，2002）。

2.2 氧化和渗透应激的交互作用将马精子暴露于低渗透压或高渗透压条件下，活精子细胞会产生更多的超氧阴离子，表明这两种刺激因素之间存在积极的相互作用。目前关于这种相互作用的机制还不清楚。但来自其他细胞类型的研究表明，膜相关磷脂酶A2（PLA2）的激活及随后NADPH氧化酶的激活可能代表在渗透应激下产生超氧阴离子的潜在途径（Lambert等，2006）。在人类精子中，PLA2的产物（包括花生四烯酸）似乎可以激活NADPH氧化酶，同时增加超氧阴离子的生成，由此导致的活性氧增加可能反过来参与蛋白酪氨酸激酶的激活，而这些蛋白酪氨酸激酶调节体积敏感的渗透通道，对维持体内平衡非常重要（Lambert等，2006）。马精子暴露于高渗条件下会改变蛋白酪氨酸磷酸化，NADPH氧化酶抑制剂和蛋白酪氨酸激酶抑制剂可以阻止这一过程（Linfor等，2002）。总之，这些研究表明，渗透和氧化应激在马精子中存在交互作用，可能改变精子功能，并可能在冷冻保存过程中对暴露于这些应激源的细胞造成复合损伤。

3 马精子的细胞凋亡

细胞凋亡是多种体细胞的典型特征，在大多数哺乳动物（包括马）的精子形成过程中发生。通过密度梯度离心分离马精子可导致较小的线粒体膜电位、膜透性改变、增加DNA碎片和天冬氨酸介导半胱氨酸蛋白酶激活（Brum等，2008）。同样，低温贮藏后，马精子凋亡的迹象包括降低线粒体膜电位变化、改变膜结构、半胱天冬酶激活。类似的结果在人和牛精子（Martin等，2007）冷冻保存后也有报道。尽管在精子亚群和冷冻保存后发现凋亡标记物，但这一发现仍存在争议，需要更多的研究来阐明冷冻保存后的凋亡变化对冷冻后马精子功能的影响。

4 结论

虽然氧化应激、渗透应激和凋亡是与精子保存相关的因素，但这些应激因素对精子的影响是相互作用的。渗透应激与各种体细胞和马精子中超氧化物的产生有关，可能是细胞适应性反应的信号机制。氧化应激可能引发马精子凋亡，对精子的许多氧化损伤特征与凋亡过程类似。还需要进一步研究这些应激对精子破坏的分子途径，以降低其在保存过程中对精子的有害影响。