胚培养技术应用于月季育种研究进展

马 策赵小慧阮 芳

(辽宁省经济作物研究所，辽宁 辽阳 111000)

月季(Rosachinensis)由于其种类繁多、花香浓郁、外观形态多种多样而被全世界范围内的各类人群所喜爱，是全球范围内关注度最高、最流行的鲜花之一，在园林绿化、医药、美容化妆、经济贸易中具有重要的观赏和经济价值。随着人们的消费能力的提升对新型抗病性状优良的月季的需求也日益剧增。但由于月季低坐果率、低种子发芽率、低成苗率以及成苗周期长，极大的制约了月季育种的快速发展。

胚培养技术，胚培养是指在体外对未成熟或成熟的胚进行离体无菌培养，获得有活力植株的技术。是培育杂交后代的一个非常重要和有用的生物技术工具。自Hanning首次进行了十字花科萝卜属(Raphanus)和辣根菜属(Cochlearis)未成熟胚培养后，大量研究者进行了广泛胚培养研究获得目的植株。胚培养技术在远缘杂交种子败育中应用尤为广泛。本文综述了胚培养技术在月季育种中的研究现状，并对月季胚培养存在的问题及将来的研究进行了展望，从而为进一步加快月季育种研究工作奠定一定理论基础。

1 月季胚培养的类型及发育途径

离体胚培养按照种子发育程度可分为未成熟胚培养和成熟胚培养两类。成熟胚培养又叫做自养期培养，指把发育到子叶期以后的胚从种皮中剥离，然后进行离体培养，对月季来说大概在杂交后30～40 d后，在此时期的胚发育较为成熟，所需培养基成分相对简单，胚不仅能够满足自身萌发和生长，还能从培养基中吸收营养，并代谢合成其生长所需的物质，培养起来较为容易。未成熟胚培养又称为异养期培养，是指在胚未发育到子叶期对具胚结构进行离体培养，对于月季来说大概30 d之前，这个时期幼胚需要从周围组织吸收营养物质以满足自身的发展。在幼胚培养时必须有适合的培养基和培养条件，幼胚培养难度大(R Drewes-Alvarez，2003)。远缘杂交胚培养通常采用幼胚培养。

离体胚培养时，主要有以下几种常见的途径：①直接成苗途径，成熟胚接种到培养基中，胚经过适应期后直接发芽形成小苗，而未成熟胚则慢慢生长增大到正常胚的大小，然后萌发成苗。作者以往研究经验发现，成熟胚和子叶期之后未成熟胚多以直接成苗的方式产生带根系完整植株。②器官发育途径，胚培养时外表面形成突起的拟分生组织，然后成苗。林娅等(2007)Schum等(2003)研究发现以月季未成熟胚为外植体，通过生成拟分生组织在30～40 d获得再生植株；③愈伤组织途径，幼胚在体外培养时首先细胞脱分化产生愈伤组织，愈伤组织经激素诱导分化成苗，月季中胚龄较小的或剥离胚的过程中产生伤口的部分胚珠以这种方式成苗。如De Wit等(1990)、Rout等(1991)、ROUTGR等(1991)花 了84～126 d的时间得到再生植株。

2 影响胚培养效果的因素

很多因素会影响月季胚培养的成功，其中最主要的因素有胚的处理方法、胚龄、培养基和培养条件等。

2.1 胚的处理方式

月季胚由于其生理性休眠和坚硬的内果皮，造成其种子中度休眠，从而抑制了种子的萌发。在进行胚培养过程中，需要采用不同措施处理胚珠以打破种子休眠。研究发现胚珠处理方法有低温冷藏、激素处理种皮、横切、切喙、裸胚培养等方法。马燕等采用赤霉素浸种和裸胚培养成熟胚，结果显示带有种皮的胚不能萌发，而去除种皮的裸胚能正常生长为植株。Marchant R等(1994)、宋杰(2011)、金菁(2010)、Serge G(1994)等研究也表明月季裸胚培养有利于成苗。林娅等(2007)采用胚切片(将带种皮的胚切成3～4瓣，取里面白色呈瓣状的胚)的方法培育现代月季未成熟胚也获得了正常植株。据报道，4 ℃低温处理果实也有助于胚的萌发并提高幼胚萌发率(Serge G，1994)。而王丽花等(2008)的研究则发现，低温处理并不能提高胚的萌发。推测可能与月季种类的不同有关，这还有待进一步研究。

2.2 胚龄

由于月季基因的高度杂合且种类繁多，不同品种及杂交组合月季胚发育程度不同，合子胚的败育程度也不同。胚龄的大小是未成熟胚培养成功的关键，幼胚过小，胚发育不完全，胚内营养积累不够，对培养条件严苛，不易养活。一般来说，胚龄与出苗率呈正相关，胚发育程度越高，幼胚发芽率越高。因此，在做胚挽救时尽量选择将要败育但尚未败育时接种。月季幼胚培养普遍认为50～80 d最为适合(王丽花等，2008；Serge G，1994)。宋杰和金菁研究月季和蔷薇远缘杂交合子胚挽救过程中发现30～36 d为最适胚龄，原因是在远缘杂交中大部分杂交种在25～40 d内开始败育，且月季杂交胚内果皮在35 d后开始木质化，木质化后内果皮坚硬，不易破皮取出胚且易对幼胚造成伤害，在种子败育和木质化前进行胚抢救是最佳时期(宋杰，2011；金菁，2010)。而Luca P等(2013)通过切片技术和不同时期胚ABA(脱落酸)含量的测定建议四倍体月季胚抢救最佳时间为15～30 d。月季易受生长环境影响，因此用花授粉后天数作胚龄的计算不太精确，有些研究者将胚发育的时期作为确定最佳接种时期的形态学指标(Notsukaetal.，2001)，宋杰(2011)研究也发现处于子叶期的幼胚培养具有更高成活率。

2.3 培养基

培养基为胚发育提供营养，远缘杂交果实败育很大原因就是不能为胚提供营养。因此，合适的培养基是胚培养成功的关键，特别对幼胚来说。幼胚常因为培养基不适合而产生非期望生长，如长成愈伤组织。而成熟胚则相反，对培养基要求简单。据报道成熟胚培养只需提供一个湿润且无菌的环境甚至不需要培养基就能萌发

(Donald，2009)。

2.3.1 基本培养基

月季胚培养的基本培养基有成熟胚和未成熟胚培养基。前者主要有Tukey、AL、MS、B5等培养基，后者主要有Tukey、MS等培养基。目前，比较公认的培养基为MS培养基。Marchant R等(1994)研究成熟胚培养时发现，AL培养基和MS培养基作为基本培养基进行胚培养无显著差别。

2.3.2 糖类

在离体胚培养中，一般都需要适量的糖类。加入糖一是为了维持适当的渗透压模拟自然生长条件，刺激胚的正常生长，二是提供所需碳源和能量。目前报道的月季胚培养糖类有蔗糖、葡萄糖、果糖以及麦芽糖等。但使用最多的是蔗糖，也有用别的糖的报道，Marchant R等(1994)研究发现葡萄糖和果糖比蔗糖和麦芽糖更有利于胚的萌发，推测可能单糖更容易被胚吸收，胚内缺乏更多相关二糖代谢合成通路。

2.3.3 激素

在培养中，需要加入外源激素，特别对未成熟胚来说。成熟胚培养物质已经积累到一定程度可自己合成生长发育所需要的激素，而未成熟胚自身合成的内源激素不能满足其正常的发育需要加入一定类型和比例的激素。不同植物和不同时期的胚培养对激素的需求很不一致。目前已报道的激素有6-BA、ZT、 Kn 、GA3、 IAA、2，4-D、BAP等，这些激素可以单一使用，也可以组合一起使用，效果不同。6-BA、GA3和NAA组合是使用最广泛的激素。Marchant R等(1994)研究发现BAP对胚的萌发无显著影响。Anuradha M等(2005)研究发现BA单独使用也能促进未成熟胚的发芽，但效果没有与GA3共同使用好。林娅等(2007)报道ZT和NAA的共同使用可以诱导月季未成熟胚生成再生芽。宋杰(2011)报道6-BA、NAA和GA3共同使用能诱导未成熟胚的发育。

2.3.4 活性炭和维生素

活性炭因其良好的吸附性被用于组培中，其作用如下：吸附作用，吸附培养基中的多酚类物质以及蔗糖在高压灭菌时产生有害物质—5-羟基糠醛，减少褐变；提供暗环境，减少由于光照造成培养基中激素IAA和IBA降解；促进根的生长。宋杰和金菁在进行月季未成熟胚培养时，加入了活性炭减少了胚的褐化率(宋杰，2011；金菁，2010)。维生素也一直用于离体胚培养中，特别是幼胚培养时，常用的是维生素C，主要作用是减少氧化，减少褐变，一般常与活性炭搭配使用效果比较好。

2.4 培养条件

2.4.1 温度

月季胚培养的温度一般为24 ℃左右。有研究表明，低温(12±2 ℃)条件可以降低一些幼胚的褐化率且提高幼胚的出愈率，而对其萌发率无显著影响(宋杰，2011；金菁，2010)。也有研究表明，在昼夜采用不同的温度有利于胚培养。

2.4.2 光照

光照也影响胚培养。Anuradha M等(2005)研究月季幼胚培养时发现，接种后14 d黑暗培养然后转入16 h/d光照培养比全光照培养和每天16 h/d光照培养胚有更高的发芽率，推测可能黑暗产生了更少的多酚类物质从而促进幼胚更好的生长，这可能是因为黑暗环境仿生了胚在果实中的发育。金菁发现在相同温度条件下，有光照的培养环境比无光照的的培养效果好。不同植物对光质的反应也不同。此外，光强对于胚培养有重要影响。不同植物对光强的反应也不同。

2.5 遗传背景

无论是自交胚还是杂交胚，不同品种月季之间杂交的幼胚的萌发率和发育情况有较大差异。研究表明，月季杂交幼胚的萌发与其父母本有一定关系，王丽花等(2008)研究发现在相同条件下，不同组合杂交幼胚形成完整植株出苗率明显不同，其中2个组合杂交幼胚明显高于其他。研究发现月季胚珠发育受父母本品种基因型的严格控制。金菁研究发现以同一个品种‘紫香红’为父本，不同的品种为母本，杂交幼胚的萌发率有显著区别，而反过来以同一个品种‘白雪山’为母本，不同品种为父本，幼胚萌发率也有很大区别(金菁，2010)。根据作者以往育种经验，月季后代表型受母本影响多一些，若母本结实性不好或者败育早，杂交之后一般也表现为结实性不好或者败育早。

3 胚培养在月季育种中的应用

3.1 克服远缘杂种胚败育

远缘杂交是育种中获得新优选植株的重要方法，通过远缘杂交，把野生型的抗病性、抗逆境性、植株长势等优良性状引入新品种中，获得性状优良的品种。但在远缘杂交中有很大一部分受精作用能正常完成，胚也能进行早期的发育。但是由于两套基因组的表达不协调，染色体核型不同(毕晓颖等，2012；刘佳，2013)，在减数分裂形成配子时分配不均，从而导致杂种胚和胚乳发育不完全，阻断了水分和营养向胚的输送以及由于胚与胚乳不相容导致的胚乳对胚胎毒害作用(Leela，2013)，造成种子的败育或形成自然条件下不发芽种子，最终在土壤中腐烂。林毅雁、王泽翻等利用蔷薇、古老月季和现代月季杂交发现杂交种子基本不萌发很难形成杂交苗(林毅雁，2010；王泽翻等，2012)。研究发现，不能发芽的胚也具备启动发育的潜力，将这类不能发芽幼胚进行体外培养，则可以 获 得 杂 种 植 株。Burger DW等(1990)、 Serge G等(1994)、Gudin(1994)、 Marchant R等(1994)等先后利用胚挽救方法获得月季种间杂交后代。金菁(2010)以月季品种‘白雪山’和‘同情’做母本，古老月季紫香红为父本进行杂交，采用胚挽救方法获得了远缘杂交种幼苗。宋杰(2011)以同情、白雪山、火焰舞为母本，野生蔷薇金樱子为父本通过幼胚培养也获得了远缘杂交幼苗。

3.2 打破种子休眠，促进胚萌发

月季种子属于中度休眠类型，休眠原因主要有：内果皮坚硬，阻止了对水分的吸收和呼吸代谢作用；果皮和种皮内所含ABA(脱落酸)的存在，抑制种子萌发；种胚发育不完整，必须经过形态后熟才能萌发。月季休眠期一般为90 d，长时间的休眠拖延育种工作高效进行。此外，月季种子发芽率非常低，据报道，一般低于20%，作者以往经验研究也发现即使经过低温层积和纤维素酶的处理，种子的发芽率也不高于30%(马策，2010)。而胚培养技术完全使幼胚可以跳过休眠，直接发育成幼苗，而且培养基中的丰富营养也有利于胚的生长发育 ( Lammerts，1946)。月季离体胚培养能在48 h后萌发，且有较高的萌发率和出苗率。Marchant R等(1994)研究发现离体胚培养比正常种植有更高的发芽率，最高能到100%。

3.3 缩短育种周期

月季植物的栽培品种一般情况下需1年才能进入花期，而通过幼胚培养，幼苗只需60～90 d即可开花，极大的节约了时间。将胚培养得到的这种花作父本，与正常生长的母本进行杂交，则1年内可产生2个世代(Lammerts，1946；Fatih Ali CANLIetal.，2009)。使育种进程得到极大的缩短，对育种者来说这是非常高效的。徐庭亮等(2016)以窄叶藤本月季为父母本进行人工杂交，通过幼胚培养方式，从杂交授粉到获得杂种植株的时间较常规方式缩短了109 d。

3.4 种子生活力的快速测定

运用常规萌发试验测定休眠种子的生活力需要很长时间，对于月季种子来说还需要进行后熟处理。月季种子有漫长的长达90 d的后熟期，在这个后熟期内种子还需要进行层积处理，对于想快速了解种子发芽情况的育种者来说，这浪费了很多时间和精力。通过胚培养可以绕过种子休眠，快速进行种子活力测定。据报道，木本植物种子的种胚在进行离体培养时，是否经过层积处理对种子萌发速率无显著影响(Rahavan，1977)。因此，用胚培养技术进行萌发实验，是快速检测种子，尤其是检测像月季一类需要经过漫长休眠期种子活力的有效方法。这种方法不但能提前了解种子的萌发率，而且与染色法相比，离体胚培养技术检测种子生活力结果更可靠、更精确。

3.5 用于挽救早期落果

月季经过育种家几百年以来的频繁杂交，基因已经高度杂合，在经过反复杂交及选育中，选育者只关注花型花色等形态特征，而不关注其基因型和染色体倍性，造成许多月季胚珠和胚发育不良，花粉活力不高。这样的花无论用于杂交还是自交均会造成大量落果。对于一些通过扦插等技术无法获得植株的月季来说，胚挽救技术是十分有效的，在落果之前摘下果实，剥除种皮进行胚培养，通过无菌快繁体系，很快就能获得大量植株。

4 展望

胚培养技术是一项高效且综合的技术，在月季新品种选育、克服远缘杂交败育、在无休眠情况下缩短育种周期、打破种子休眠获得高萌发率植株、提高育种效率等方面发挥着不可替代的作用。尽管它已在育种中取得了很大成绩但仍然存在很多不足。如缺乏高效的用于去除内果皮工具，目前应用的工具主要是钳子、解剖刀等，这些工具极大的制约了胚培养技术在月季育种中的的应用；缺乏一套高效的通用的培养体系，不同品种的月季在对激素和培养条件及发育时期不同造成了每个品种均需要摸索条件，而远缘杂交果实结实率非常低，供试材料有限，限制了胚培养应用；胚的发育途径太多，经常出现非期望生长，例如生成愈伤组织，没有稳定的成苗路径获得目的植株等。因此，将来我们需立足已有研究，开发一套高效稳定的培养体系，并通过与分子辅助育种技术、分子早期筛选技术有效结合，进一步缩短育种周期，在有效时间内培育出更优质的月季新品种。