女性生殖系统肿瘤患者的微生物群在肿瘤中的作用的研究进展

唐 杰，何 京综述，张金艳审校

0 引 言

人体的不同部位含有不同种类的微生物，这类微生物被称为微生物群。人类与其微生物群之间的关系是复杂的；微生物也是体内平衡最重要的组成部分之一。微生物组-宿主内环境平衡与肥胖、多种癌症、早产、炎症和过敏性疾病以及神经发育障碍有关。一些癌症和微生物，如胃淋巴瘤和幽门螺杆菌感染，已经建立了直接而又强有力的因果关系。也就是说，幽门螺杆菌感染可能会导致胃淋巴瘤，根除感染源则具有治疗效果。癌症和微生物群落之间的联系较复杂，微生物群落的转变可通过炎症、微环境变化或破坏脱氧核糖核酸的毒素导致各种癌症。理解导致失调的机制，我们将能够阐明导致恶性肿瘤的途径和研究新的治疗方式。临床诊断中，由于培养技术的局限性，通过二代测序(next generation sequencing,NGS)技术越来越多地研究不同身体部位的微生物群的组成，可能检出一些与卵巢癌或宫颈癌相关的非正常微生物菌群。相应的，在患者标本中检测到了这些微生物群是否可以作为相关肿瘤的辅助生物学指标。本文就微生物组成在女性恶性肿瘤中的作用研究进展作一综述。

1 微生物组成的检测技术

1.1 早期微生物组成检测技术早期检测技术较局限，主要依赖显微镜和培养来鉴定[1]。显微镜技术是鉴定病毒以外的微生物，借助染色鉴别细菌形态、结构和染色特性。培养技术是依据经验创造细菌赖以生存的环境，鉴别细菌的菌落颜色、大小等培养特性。随着分子技术的发展，可能被测序技术逐渐取代。

1.2NGS

1.2.1 NGS发展历程1977年，Fred Sanger在文章中描述了双脱氧链终止子测序；1981年，Anderson等发现了人类基因组的第一部分—线粒体DNA；1995年，Fleischmann等发现了流感嗜血杆菌的首个完整的细菌基因组[2]。1996年，世界范围的努力产生了第一个完整的真核基因组——酿酒酵母。很明显，21世纪初人类基因组的发表是基因组学兴起的主要原因，标志着测序时代的开始，现代科学家才有可能直接研究遗传分子。然而，大规模的DNA测序有许多缺点，包括昂贵的试剂成本和操作测序平台所需的大量人力资源[3]。

2005年，454生命科学公司(现为罗氏公司的一部分)发布了焦磷酸测序技术，引发了一场革命。这种被称为NGS的高通量技术，运行一次产生数千到数百万个短序列读数。此后，许多NGS技术相继出现，包括自2006年以来由索莱克斯/艾默娜测序仪使用的合成测序技术，该技术目前占据了NGS市场的很大一部分。由于仪器和新技术的不断出现和不断改进，二代测序领域非常活跃[3]。这些不仅对于获得有关细菌基因组的基础知识至关重要，而且对于开发测序策略并为未来的微生物基因组学和转录组学奠定基础至关重要。

NGS可分析从患者体内分离的细菌菌株的抗生素耐药性，检测多态性与疾病表现或严重程度之间的联系。NGS的另一个重要应用是实时追踪流行病，还可用作追踪医院环境中细菌转移的临床工具[2]。NGS技术包括多层样品收集、制备和分析。测序数据的使用超越了基础科学的核心，但也是转化研究的基础，可用作诊断工具，用于治疗风险评估或临床干预。NGS的使用扩展了诊断微生物学和流行病学的能力。使用核糖核酸测序技术可以详细研究细菌细胞中复杂的调节过程。

1.2.2常见的NGS技术①16S rDNA测序：检测编码细菌16s rRNA的DNA序列，定量评估各种微生物群落中物种的组成和比例。其中Illumina Miseq平台性价比最高，检测细菌16S rRNA基因V3～V4高变区覆盖率广且质量高。②全基因组shotgun测序：对整个或全基因组进行测序。③IS-pro技术：基于每种细菌特异性的IS区域长度来分析。④定量(实时)PCR：能够检测定量变化[1]。

2 微生物群与癌症

定植于人体的微生物统称为微生物群。人体为定植的微生物提供适宜且营养丰富的微环境，微生物群则有益于促进人体代谢和免疫调节。健康人由于遗传、饮食、环境和其他很大程度上未知的因素，显示出不同的微生物组分。

致癌作用是感染因子、宿主状态(基因多态性和免疫功能状态)和环境因素(吸烟、化学物质、电离辐射和免疫抑制剂)等多种因素共同作用的结果。癌症的出现依赖着细胞代谢的改变和炎症，宿主-微生物间的相互作用可能不是癌症发生的直接条件，有可能是间接的。直接致癌物如HTLV-1和KSHV，表达病毒致癌基因引起癌变；间接致癌物如幽门螺旋杆菌，引起慢性炎症导致细胞癌变，最终演变成胃癌[4]。这些疾病往往不是由于单一病原体的改变，是微生物相对丰度的改变。短期生物失调对癌症的影响不大，但生物失调的持续时间长以及可能与其他危险因素的联合作用，则发挥较大的临床意义。感染的持续和反复导致的炎症浸润和菌群失调，是重要的危险因素，女性生殖系统肿瘤中微生物组成的潜在致癌作用是本篇综述想要阐述的内容。

3 上生殖道的微生物群

细菌定植在人体的大部分部位，其中也包括女性生殖道。尽管已经确定了阴道微生物群的存在，但是很多人认为上生殖道是无菌环境，并且一般认为细菌的存在与不良的临床表现有关。有宏基因组学研究发现子宫,输卵管,卵巢和胎盘存在着特定菌群。虽然微生物多样性被认为是许多身体部位健康的标志，但高度多样性的阴道微生物群通常被认为是非典型的或生物失调的状态，并与疾病状态相关联。

阴道微生物群的组成受许多因素的影响。种族是一个主要的内在因素，亚洲女性乳酸杆菌占明显优势。阴道微生物群主要由卷曲乳酸杆菌、乳酸杆菌、加氏乳酸杆菌或詹氏乳酸杆菌组成，并通过乳酸生产和免疫调节在内的几种其他机制降低阴道酸碱度来预防泌尿生殖系统疾病。Ravel等[5]描述了四种类型的乳酸杆菌群落，第一、第二、第三和第五组，分别由卷曲乳酸杆菌(L.crispatus)、加氏乳酸杆菌(L.gasseri)、惰性乳酸杆菌(L.iners)和詹氏乳酸杆菌(L.jensenii)组成，与其他四类群落相比，第四类群落含有更高比例的严格厌氧微生物，与阴道酸碱度显著降低有关，这有可能升高感染的风险，提示乳酸杆菌在维持机体免疫功能方面具有重要的保护作用。Nené等[6]又将Ravel的四个乳酸菌群落I、II、III和V组成一个微生物群落，称之为L型群落。并将样本分为宫颈阴道菌群组成至少为50%的L型人群和微生物群组成少于50%组成的L型人群，称为O型群落。O型群落的细菌多样性更高，由典型的专性和兼性厌氧菌属(如加德纳菌属或阿托波菌属)组成，与需氧性阴道炎和细菌性阴道炎有关。细菌性阴道病的特征是健康微生物群的转变，其中的主要细菌菌群乳酸杆菌被加德纳氏菌属(Gardnerellaspp)、阿托波菌属(Atopobiumspp)、支原体和普氏菌属(Prevotellspp)等其他菌种取代。细菌性阴道病是阴道微生物群的一种病理状态，其特征是乳酸杆菌下降和厌氧菌升高，厌氧菌释放挥发性胺，其中一些胺转化为致癌物质[7]。

Virtanen等[8]利用NGS检测宫颈中的微生物群，对10名绝经前的芬兰妇女进行了采样，主要收集的是阴道穹隆，阴道壁和子宫颈的样本。根据16S rRNA基因的Illumina MiSeq测序，比较样品的DNA和蛋白质产量，细菌载量，微生物群多样性和物种组成。研究还记录了受试者吸烟情况，避孕药使用情况，末次月经以及最近的抗生素使用情况等影响因素。实验重点是对16sRNA基因的高变V1-V3区进行测序产生的微生物区系。实验检测到这10名妇女的优势细菌是乳酸杆菌属、巨球菌属、普氏菌属和阴道阿托波菌属。个体之间差异很大，10名妇女中有6名微生物群以乳酸杆菌为主，其余的妇女中以肠杆菌科、Lachnospiraceae(毛螺菌科) BVAB1、普氏菌属或巨球菌属为主。在以乳酸杆菌为主的6例患者中4例患者以惰性乳酸杆菌为主(CST Ⅲ型)和2例以卷曲乳酸杆菌为主(CST Ⅰ型)。

4 人乳头瘤病毒(human papilloma virus,HPV)与微生物群

HPV据研究有200多个HPV基因型，40多个基因型与生殖道粘膜有亲和力，可通过性接触传播。人体会在几年内消除大多数HPV感染，未被免疫系统清除的HPV感染可能会导致严重健康后果。低风险HPV往往引起良性异常，即生殖器疣。高风险的HPV基因型是公认的宫颈癌(cervical cancer,CC)、外阴癌、阴茎癌、肛门癌和口咽癌的致癌因素[9]。

人持续感染高危型HPV(high risk human papilloma virus, HR-HPV)是CC发展的主要诱因[10]。CC及其癌前病变，宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasia,CIN)的重要风险因素之一就是HPV感染，感染HPV对其发生过程来说是必要的，但还不足以导致最终病理改变。免疫缺陷[11]、吸烟和口服避孕药等因素,可能会影响病毒感染以及感染后的病理改变。除HPV感染外，微生物群落组成也可能在宫颈癌发生中起作用。最近，越来越多的证据表明，宫颈阴道微生物群可能是CC病因的重要辅助因子。阴道微生物平衡可能在宫颈癌的发生发展中起重要作用[12]。宫颈阴道微生物群通过升高酸碱度在宫颈癌中发挥潜在作用已有报道。阴道微生物群失调会导致多种妇科疾病，如CIN和宫颈癌。同时，宫颈癌会破坏正常的阴道和子宫颈黏膜，从而导致正常菌群与非正常菌群之间的比率发生变化[13]。

Onywera等[14]收集了87名南非黑人育龄妇女的宫颈样本，用Illumina测序法对细菌16srRNA基因V3-V4高变区的微生物群进行了鉴定。研究结果显示，与低风险HPV感染或无HPV感染的妇女相比，高风险HPV感染的妇女气球菌科、假单胞菌科和双歧杆菌科，加德纳菌、纤毛菌和阿托波菌的相对丰度明显较高。Chen等[15]研究结果表明，妊娠和HPV感染伴随着CST I(以卷曲乳杆菌为主)比例的增加。双歧杆菌科、芽孢杆菌属、巨球型菌属、纤毛菌属、普氏菌以及加德纳菌，Fastidiosipila和戴阿利斯特杆菌属是受hrHPV感染的女性的生物标志物。

总而言之，患者感染HPV后微生物群丰度增加，主要表现为乳酸杆菌比例降低，非乳酸杆菌比例增加。感染HPV增加的微生物是否可作为一个生物学指标还需要更多临床研究来证明。

5 宫颈癌微生物群

5.1 存在HPV感染的宫颈癌患者的微生物群OH等[16]使用16S rRNA基因的焦磷酸测序分析了70名CIN(宫颈上皮内瘤变)患者和50名对照组患者的宫颈菌群，发现阴道阿托波菌、阴道加德纳菌和乳酸杆菌作为宫颈微生物群的优势菌与CIN风险相关，提示细菌失调及其与致癌的HPV的结合可能是宫颈癌的危险因素。人类乳头瘤病毒阳性妇女(34例)的拟杆菌门、放线菌门、软壁菌门和变形菌门等的丰度高于人类乳头瘤病毒阴性妇女(14例)。Zhang等[17]使用基于16S rRNA基因的Illumina测序分析了126名CIN 1型和40名CIN 2+ (CIN 2型和CIN 3型)妇女的宫颈微生物群。发现CIN与脆弱拟杆菌、德氏乳酸杆菌和无乳链球菌间接相关。aniewski等[18]的研究证明与宫颈癌相关的微生物群组成主要有纤毛菌属、奇异菌属、假单胞菌属、梭杆菌属、厌氧菌属和消化链球菌属。

5.2艾滋病患者微生物群Klein等[19]收集了144名坦桑尼亚妇女的宫颈刷样本，对细菌16sRNA基因进行测序发现，在感染HPV背景下，艾滋病毒阳性患者比艾滋病毒阴性患者微生物群丰度更高。HPV感染进展取决于宿主免疫状态，不论是艾滋病毒阳性还是非乳酸杆菌丰度增高均可提示这两种因素在存在HPV感染的前提下加剧了宫颈癌变，这可能允许某些子宫颈微生物群被用作诊断宫颈癌高危人群的标志物，预防性补充益生菌或进行抗生素治疗可以促进健康的微生物群定植，可能会减缓病变进程；长期关注微生物群的变化是否可前瞻性预测病变发展还需要大量进一步临床研究。

6 卵巢癌患者的微生物群

有证据表明阴道细菌可通过子宫颈上升至上生殖道，但这些部位的细菌定植似乎与阴道定植菌落不同。Pelzer等[20]证明女性上生殖道不是无菌的，对16个接受全子宫切除术的妇女的输卵管进行检测，检测结果中涉及的主要菌种有葡萄菌属、肠球菌属、假单胞菌属、乳酸杆菌属、伯克霍尔德氏菌属以及丙酸杆菌属。Miles等[21]收集10个接受全子宫切除术和双侧切除术的妇女卵巢样本，对16S rRNA基因的V1-V3区进行扩增和测序来检测每个样本的微生物组成。主要有厚壁菌门、变形菌门、放线菌门、拟杆菌门。Lin等[22]进行的一项基于人口的研究表明患盆腔炎的妇女患卵巢癌的风险增加。一些组织也报道了衣原体和生殖器支原体可能与卵巢上皮性肿瘤有关。Zhou等[23]采用16S rRNA高通量测序方法，分析了卵巢癌组织(25份样品)和正常输卵管远端组织(25份样品)微生物群落的多样性和组成。他们的高通量测序结果显示卵巢癌组织的多样性和丰富度指数与正常输卵管远端组织相比明显降低。在卵巢癌中，变形杆菌/厚壁菌门的比率显著增加，这表明微生物组成的变化可能与卵巢癌的发展过程有关。Miao等[24]提出了用血清学肿瘤标志物和微生物特征来检测卵巢癌，分析了30名患者样本，指出有18种OTU与卵巢癌诊断高度相关，主要涉及普氏菌属、拟杆菌属、厚壁菌门、梭菌属、毛螺菌科、疣微菌门。卵巢癌是由多种复杂因素引起的，但其与微生物和感染相关的病因尚不清楚。

7 结语与展望

宫颈癌、卵巢癌这两种女性生殖道恶性肿瘤,发病率较高。早期临床发现，早期治疗对患者治疗及预后有积极意义。了解两种生殖道恶性肿瘤的高危因素，更能够有利于早防早治。其中宫颈癌的高危因素主要是HR-HPV的感染，然而可能必要但不完全，后期的正常菌群紊乱带来的负面影响加剧了这一过程，在HR-HPV感染的前提下检出与宫颈癌相关的非正常微生物菌群(阴道加德纳菌、阴道阿托波菌、假单胞菌属、拟杆菌属等)将可能作为一个宫颈癌的先兆危险信号，来提醒临床医师以及患者。

临床诊断中，由于培养技术的局限性，通过NGS技术越来越多地研究不同身体部位的微生物群的组成，检出一些与卵巢癌或宫颈癌相关的非正常微生物菌群。在接下来的实验中，希望通过NGS技术对宫颈癌及卵巢癌患者的宫颈拭子或是卵巢组织标本进行微生物菌群检测，来获取相关实验数据，进一步印证上述观点。