Caerin多肽在提高人乳头瘤病毒相关恶性肿瘤治疗性疫苗效率中的研究进展

马博伟综述，倪国颖，王天放，陈波蓓审校

0 引 言

近年来，免疫治疗逐渐成为肿瘤治疗的新手段，免疫检查点抑制对多种恶性肿瘤显示出明确的疗效和巨大的潜能[1-3]。免疫检查点抑制剂如抗PD-1、抗CTLA-4抗体等对包括宫颈癌、HPV相关头颈部肿瘤在内的临床试验中也显示出明确疗效[4-6]。但是，免疫检查点抑制剂对相当一部分肿瘤无效，仍需进一步提高疗效[7]。治疗性疫苗通过诱导细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte, CTLs)特异性杀死肿瘤或病毒感染细胞，理论上不伤害正常细胞，已成为包括宫颈癌免疫治疗在内的肿瘤免疫治疗领域的研究热点[8]。动物实验和临床试验结果也表明，治疗性疫苗与免疫检查点抑制治疗联合使用，可进一步提高免疫检查点的效率[8-9]。本文对人乳头瘤病毒(human papillomavirus, HPV)相关肿瘤治疗性疫苗的研究现状作一综述，重点就Caerin多肽提高HPV相关肿瘤治疗性疫苗效率进行的探索。

1 HPV相关恶性肿瘤

HPV慢性持续感染可引起多种良性和恶性疾病。宫颈、外阴、肛门癌和部分头颈部肿瘤均可由感染HPV引起。2012年HPV持续感染引起的癌症占当年一千四百万新诊断癌症患者的4.6%[10]。2018年的统计表明，HPV相关癌症占所有二百二十万与感染有关癌症的29.1%，而几乎100%的宫颈癌均由HPV感染引起[11]。

宫颈癌是常见恶性肿瘤之一，发病率占女性恶性肿瘤第四位，其中高危HPV 16型或18型在宫颈癌中最常见，约50%的宫颈癌发生与感染HPV16有关， 20%的宫颈癌发生与HPV18有关[12]。HPV预防疫苗主要由HPV晚期L1衣壳蛋白组成，L1蛋白可在体外自主组装成病毒样颗粒(virus like particles，VLPs)，VLPs可诱导机体产生抗L1中和抗体，从而预防HPV病毒感染[13]。尽管用于预防HPV 感染的疫苗早已于2006年开始应用，但此类疫苗仅适用于从未感染的健康个体，对现症HPV感染及其所致疾病无效[14]。虽然宫颈癌预防性疫苗已经在世界范围内使用，宫颈癌仍是妇女，尤其是发展中国家妇女最常见的恶性肿瘤之一[12]。2018年全球宫颈癌新诊断人数为570 000人，死亡 311 000人[15]。我国现有宫颈癌患者40万人，死亡率达11.3%[16]。

头颈部鳞状细胞癌(head and neck squamous cell carcinoma, HNSCC)是全球第六大最常见的癌症，每年新诊断患者60万，死亡人数超过30万人[17]。根据HPV相关性，HNSCC患者可分为两类不同的亚群，HPV阴性的HNSCC可能与环境致癌物、烟酒消费有关；而HPV阳性的HNSCC主要由HPV16亚型引起。HPV阳性的HNSCC好发于口咽部、扁桃体或舌根鳞状上皮内，通常见于不吸烟的年轻患者。许多HNSCC表现为局部进展性疾病，常伴有明显的淋巴结受累[18]。局部晚期疾病采用手术、放疗和化疗相结合的方法，只有约50%的患者能治愈。HPV阳性肿瘤相对于阴性肿瘤具有更好的临床治疗效果[19-20]。我国南方HPV相关HNSCC患者约占所有HNSCC的26.4%，口咽癌HPV的阳性率达到了38.5%[21]。

2 HPV相关疾病的治疗性疫苗研究现状和存在问题

目前，国内外HPV治疗性疫苗仍处在试验探索和研发阶段。HPV治疗性疫苗的靶抗原明确，主要集中在HPV早期抗原E6和E7。HPV相关恶性肿瘤中E6，E7持续表达，是主要的致癌蛋白。已有多篇文献发表有关HPV治疗性疫苗的综述[8,22]。疫苗主要包括DNA(基因疫苗)、mRNA疫苗、各种细菌或病毒载体搭载的疫苗、蛋白质、细胞和肽类疫苗等[23]。

迄今，国际上已有多篇文献报道了HPV相关治疗性疫苗的临床试验结果，但仅个别，如含弗氏不完全佐剂的长HPV16 E7多肽疫苗和一种核酸疫苗显示对HPV感染癌前病变如CIN3或VIN3有疗效[24-26]，但对宫颈癌疗效不明确。现阶段，HPV治疗性疫苗主要问题是接种HPV治疗性疫苗虽然可诱导患者产生CTLs，这些T 细胞也可浸润到肿瘤组织，但是对患者的生存时间无改善。如何优化HPV相关疾病治疗性疫苗、提高其疗效，已成为HPV相关疾病治疗性疫苗研究领域亟待解决的命题。理想的HPV治疗性疫苗应该：①诱导产生高质、足够数量的效应T细胞细胞；②这些T细胞可迁徙到肿瘤组织；③克服肿瘤微环境的免疫抑制作用，有效杀死肿瘤细胞[14, 24-27]。

3 免疫时阻断白介素10可提高治疗性疫苗疗效

3.1 IL-10IL-10是一种由多种特异性和非特异性免疫细胞分泌的细胞因子，IL-10家族细胞因子由IL-10、IL-19、IL-20、IL-22、IL-24、IL-26、IL-28A、IL-28B和IL-29组成[28]。具有多种生物学功能，可抑制机体对外源和自身抗原过度的免疫反应，避免对机体自身免疫损伤，维持上皮层的完整性，促进对致病性感染的固有免疫反应，促进损伤中的组织愈合过程，抑制促反射反应，限制不必要的组织破坏[28]。抗原提呈细胞如树突状细胞、巨噬细胞，辅助T 细胞，如Th1、Th2和Th17细胞以及CD8+T细胞，在特定条件下均可分泌IL-10。IL-10的主要功能是通过与细胞膜上的IL-10受体(IL-10R)结合，降低炎症反应。IL-10通过作用于抗原递呈细胞，抑制CD8+T和Th1、Th17等细胞反应[29-31]。

3.2阻断IL-10提高疫苗诱导的细胞毒性T细胞反应乳头瘤病毒(papillomavirus，PV)的主要衣壳蛋白L1致敏(primed)的小鼠，在接种携带HPV16E7 CTLs决定簇的PV嵌和型L1蛋白(L1E7)后，与未致敏小鼠相比，E7特异性的CTLs细胞分泌干扰素伽马(IFN-γ)受到抑制。但在 L1E7免疫PV L1致敏小鼠时，同步用IL-10受体抗体阻断IL-10信号传递，E7特异性CTLs不受到抑制[32-34]。

基于多肽的治疗性疫苗易生产，便于保存而受到研究者的重视。长HPV16 E7多肽(Long E7 peptide)/IFA疫苗是经过随机对照双盲临床试验证实对宫颈癌癌前病变有明确疗效的[28]。对比研究发现HPV16 E7长肽/脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)/抗IL-10受体抗体疫苗比HPV16 E7 长肽/IFA诱导产生更多的E7特异性CTLs，并且促使更多的分泌干扰素γ的CD4+和CD8+T细胞浸润肿瘤组织[35-36]。两种免疫方法均可抑制HPV16 E6/E7转化的TC-1小鼠肿瘤的生长，且抑制水平一致。免疫时阻断IL-10还可提高诱导次要抗原决定簇CTLs的能力。另外，已在临床上使用的佐剂MPLA，一种优化的LPS类似物，皮下使用抗IL-10R抗体，也可提高疫苗诱导CTLs的能力[35-36]。

3.3含IL-10阻断剂的治疗性疫苗更好的抑制肿瘤生长无论免疫原是病毒样颗粒、多肽、可溶性抗原或核苷酸，免疫时使用IL-10受体单克隆抗体阻断IL-10可显著增加疫苗诱导抗原特异性CD8+T细胞反应[37]。HPV16 E7长肽/脂多糖 (LPS)/IL-10 阻断(抗IL-10R 抗体)疫苗和HPV16 E7长肽/IFA 免疫后，这两种免疫方法与未经免疫的荷瘤小鼠相比，其肿瘤组织中IFN-γ的水平相似，比未免疫对照组肿瘤高；但是IL-10水平三者相似，提示肿瘤组织中的IFN-γ对抑制肿瘤起重要作用，而免疫时阻断IL-10，不影响肿瘤组织中IL-10 总体水平[35-36]。免疫时阻断IL-10，比单纯免疫可更好抑制TC-1肿瘤的生长[38-39]。这些结果表明IL-10信号传导阻断对癌症治疗疫苗是有益的。疫苗诱导的IL-10而不是源自肿瘤的IL-10决定了治疗性疫苗的效力[38]。然而，当含有不诱导IL-10的佐剂的疫苗，如TLR3激动剂(Poly(I:C))或抗CD40抗体时，由于这些佐剂刺激的树突状细胞(DC)不产生IL-10，因此抗IL-10R抗体将不会对肿瘤生长提供任何有益的作用[39-40]。 IL-10在免疫应答的T细胞激活和启动阶段是有害的，通过抑制抗原递呈和减少MHC Ⅰ、Ⅱ和树突状细胞膜上的共刺激物表达来抑制树突状细胞。因此，阻断树突状细胞疫苗上的IL-10信号会产生更强的抗肿瘤反应[38]。

4 肿瘤微环境对效应T细胞的抑制作用

肿瘤的发生和发展是肿瘤与机体免疫系统不断斗争并取得胜利的结果。肿瘤微环境的组成包括肿瘤局部浸润的免疫细胞、间质细胞及肿瘤细胞等。间质细胞又包括肿瘤相关成纤维细胞、淋巴细胞、骨髓前体细胞和循环血小板等细胞[41-43]。肿瘤微环境中存在大量的免疫抑制细胞，如调节性T细胞，免疫抑制性的抗原提呈细胞等，可直接或通过分泌免疫抑制细胞因子，如IL-10，TGF-β对效应T细胞，特别是CTLs的功能进行抑制[44]。 肿瘤微环境中M2表型巨噬细胞的增多，M2表型的巨噬细胞具有分泌促肿瘤生长炎性因子，特别是IL-10和CCL-2升高，从而引起肿瘤细胞迁徙和转移。 因此，提高治疗型疫苗的效率需要使免疫微环境从免疫抑制变成免疫促进状态[42,45]。

5 Caerin多肽体内外抑制肿瘤生长

分离自两栖动物澳大利亚树蛙皮肤分泌物的天然多肽Caerin 1.1具有广谱癌细胞细胞毒性作用,包括对白血病、肺癌、结肠癌、黑素瘤、卵巢癌、肾癌、前列腺癌和乳腺癌细胞的体外细胞毒性作用等，Caerin 1.9具有广谱的抗革兰氏阳性和阴性细菌的能力[46-48]。

Caerin 1.1 和 1.9两者结合使用体外抑制HPV16E6/E7转化的TC-1肿瘤细胞，宫颈癌Hela细胞生长有叠加作用，而相同剂量的Caerin 多肽对正常细胞无毒性[49-50]。Caerin1.9可进入到TC-1和HeLa细胞内，Caerin 1.9进入细胞内的速度和位于细胞内的位置不同[50]。Caerin 1.1和Caerin 1.9诱导TC-1和人宫颈癌HeLa细胞凋亡，可能通过TNFα介导的凋亡信号诱导HeLa细胞凋亡[50]。Caerin多肽二级结构α螺旋-中部铰链-α螺旋，能够影响细胞膜结构，造成细胞膜功能的破坏，导致有过量离子和小分子穿过细胞质膜双层，最终导致细胞裂解而造成细胞死亡[51]。Caerin多肽可通过Tec激酶信号传导和LXR/RXR通路引起急性炎症[49]。的确，Caerin1.1和Caerin1.9使TC-1细胞分泌更多的IL-6[49]。放射性碘可被连接到caerin多肽上。放射性碘标记的Caerin 1.9在体外抑制肿瘤生长的效率比未标记的Caerin 1.9高100倍，与游离的放射性碘比较，杀伤肿瘤细胞的效率更高[52-53],同样，放射性碘标记的Caerin 1.1在体内抑制肿瘤生长的效率比未标记的Caerin 1.1更高，抑制肿瘤生长的效率更强[54]。Caerin 1.1和Caerin 1.9局部肿瘤注射可抑制小鼠TC-1肿瘤，小鼠B16黑色素瘤生长[49]。

6 Caerin多肽提高治疗性疫苗疗效

HPV16E7长肽(EX)/MPLA/抗IL-10抗体皮下免疫加上肿瘤局部注射Caerin多肽可显着增加TC-1荷瘤小鼠的存活时间[55]。与PBS处理的对照组相比，仅用EX/MPLA/抗IL-10R抗体进行免疫接种，或仅肿瘤局部注射caerin多肽进行免疫接种，不增加TC-1荷瘤小鼠的生存时间[55]。 此外，如果使用HPV16E7长肽(EX)/MPLA/抗IL-10抗体皮下免疫加上肿瘤局部注射Caerin多肽， 联合PD-1免疫检查点抗体，可使40%的小鼠完全清除TC-1肿瘤，高于HPV16E7长肽(EX)/MPLA/抗IL-10抗体皮下免疫加上肿瘤局部注射对照多肽(20%)。

7 Caerin多肽改善免疫微环境的机制

Caerin多肽除直接的细胞毒外，还募集更多的T细胞和NK细胞到肿瘤部位[56]。Caerin多肽抑制小鼠TC-1肿瘤生长需要特异性免疫系统的存在，因为Caerin1.1和Caerin1.9抑制TC-1肿瘤生长的作用在裸鼠消失[55]。Caerin多肽抑制肿瘤生长的机理可能是除了直接的细胞毒外，还促进肿瘤细胞分泌炎性因子，吸引免疫细胞到肿瘤组织，有可能改善了肿瘤微环境的对效应细胞的免疫抑制作用。

未经治疗的TC-1肿瘤、HPV16E7长肽(EX)/MPLA/抗IL-10抗体皮下免疫，联合PD-1免疫检查点抗体，结合TC-1肿瘤局部注射Caerin多肽或对照多肽的TC-1肿瘤内浸润白细胞的数量和功能单细胞RNA测序(ScRNA sequencing)TC-1肿瘤组织内可鉴定出19个细胞群。包括巨噬细胞，CD4+，CD8+，CD4+CD8+，CD4-CD8- T细胞，B细胞，NK细胞，中性粒细胞和抗原提呈细胞等。未治疗组的巨噬细胞，占所有肿瘤组织内白细胞的50%，Caerin治疗组占47%，对照组42%。这些巨噬细胞可根据其基因表达的不同，分为六个群，从免疫抑制型M2，到免疫促进型巨噬细胞，分别为M2 MΦ,MHCIIhiMΦ, MΦ/DCs,Ear2hiMΦ, MΦ/NKT and TAMs巨噬细胞。未治疗组含大量Arg+的M2巨噬细胞，与未治疗和对照多肽治疗组相比，Caerin多肽治疗组Arg+的巨噬细胞量显著减少，MHCIIhiandEar2hi巨噬细胞明显增多。此外，Caerin多肽局部肿瘤注射和对照多肽治疗性疫苗免疫和PD-1抗体治疗显著促进了CD8+T细胞肿瘤组织浸润；而Caerin多肽治疗组的CD8+T细胞表现出更强的免疫激活状态，与对照多肽治疗组比较，Cd8a,Cd8b1,Tox,Ifng,Prf1和Rgs16的表达显著增高，CD8+T细胞中记忆T细胞和效应记忆T细胞明显增多。Caerin治疗的TC-1肿瘤组织中免疫刺激状态的NK细胞也比对照多肽治疗组明显增多。B细胞在TC-1肿瘤模型中具有免疫抑制作用，与未治疗组和对照多肽治疗组相比，Caerin多肽治疗组的B细胞几乎消失，而B细胞在TC-1肿瘤模型中具有促进肿瘤生长的能力[57]。蛋白组学分析结果表明，stat1信号传导通路介导的细胞凋亡和一氧化氮的产生。此外，蛋白质组与单细胞转录组的计算整合与Caerin多肽治疗后免疫抑制性B细胞功能的失活一致。

8 结语与展望

HPV引起的相关疾病严重危害人类健康，急需研发新的有效治疗手段。免疫治疗HPV相关疾病是研究的热点和发展方向。免疫时使用抗IL-10受体抗体或IL-10抑制肽暂时阻断IL-10，可提高治疗性疫苗诱导的T细胞反应，增加T细胞数量，延长生存时间。肿瘤微环境对治疗性疫苗诱导产生的免疫细胞有抑制作用，使CTLs细胞不能充分发挥抗肿瘤效应。来自两栖动物分泌物的合成Caerin多肽在体内外具有广谱的抗肿瘤效果。Caerin多肽性质极其稳定，能够通过Tec激酶信号传导和LXR/RXR通路引起急性炎症和诱导癌细胞凋亡，改善免疫抑制的肿瘤微环境，重新激活免疫细胞靶向攻击肿瘤，杀伤肿瘤细胞。对Caerin多肽改善肿瘤微环境的机理深入研究，研发控制释放长效Caerin多肽有助于进一步提高其提高治疗性疫苗的效率。