免疫组织化学及特殊染色技术在法医损伤病理学鉴定中的应用

陈学士，褚俊，杨利军，王涛，陶陆阳

1.苏州大学法医学系（司法鉴定中心），江苏 苏州 215021；2.苏州市公安局刑事警察支队，江苏 苏州215131

常规组织病理学技术如甲醛溶液固定组织、石蜡切片制备、苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色在法医病理学诊断中发挥了重要作用。然而在法医损伤病理学鉴定实践中[1-3]，常遇到损伤时间推断、损伤并发症鉴定等疑难问题。损伤时间推断主要包括生前伤与死后伤鉴别、皮肤损伤时间推断、外伤性迟发性脾破裂（traumatic delayed rupture of spleen，TDRS）损伤时间推断、血栓形成时间推断、创伤性脑损伤（traumatic brain injury，TBI）及硬脑膜下血肿（subdural hematoma，SDH）形成时间推断等，损伤并发症主要包括脂肪栓塞、挤压综合征及骨筋膜室综合征的诊断等。免疫组织化学（immunohistochemistry，IHC）及特殊染色技术有助于解决上述问题。由于IHC 和特殊染色技术具有操作简便、不需要昂贵仪器、可同时检测多种指标等优势，在法医损伤病理学实践中得到了广泛应用。本文综述IHC 和特殊染色技术在法医损伤病理学实践检案中损伤时间推断和损伤并发症鉴定的应用和价值，以期为法医工作者提供参考。

1 损伤时间推断

损伤时间包括人体死亡前形成的损伤和活体上损伤所经历的时间[2]，法医病理学中的损伤时间是指从受伤到死亡经历的时间，对损伤时间进行推断和认定是判断损伤与死亡关联性的前提。损伤时间推断的首要任务是鉴别生前伤与死后伤，进一步推断伤后存活时间。生活反应是损伤局部及全身皆可出现的防卫反应，是确定生前损伤及推断损伤后存活时间的基础，可通过肉眼观察和组织病理学技术检测[1]。

1.1 生前伤与死后伤鉴别

生前伤是活体受暴力作用造成的损伤，死后伤是死后受暴力作用造成的损伤，鉴别生前伤与死后伤的意义在于判断死者真正的致死因素[1]。生前伤与死后伤的鉴别主要基于生活反应，如肉眼观察到的出血、组织收缩、肿胀、痂皮形成、创口感染、异物移动等，以及组织病理学变化，如血栓栓塞形成、炎症反应及损伤愈合等[1]。早在20 世纪60 年代初，RAEKALLIO[4]通过酶组织化学技术检测人体皮肤切创中心区和周边区酶活性变化对生前伤与死后伤进行鉴别。国内法医学者亦通过特殊染色技术对生前伤与死后伤的鉴别进行了一系列研究：卢庆林[5]对人体生前与死后皮肤切创进行Hart 氏改良弹力纤维染色，发现无论是不同时间的生前伤还是不同时间的死后伤，其真皮中弹力纤维均具有相似的形态结构，如呈波浪状、网状、点状及点片状，因此，无法依据真皮中弹力纤维形态学变化鉴别生前与死后皮肤切创。李真等[6]对生前缢死、勒死13 例和死后悬尸5 例索沟处皮肤组织进行弹力纤维染色，发现生前索沟处皮肤弹力纤维因收缩而变得粗细不均，断端呈多形性改变，如卷曲、膨大、分叉或呈蝌蚪状、球拍状；死后索沟处皮肤弹力纤维粗细相差不悬殊，断端多整齐、平直。因此，应用弹力纤维染色有助于鉴别生前和死后索沟。赵枢泉等[7]报道，即使对水中腐败尸体的鉴定，仍可通过绪方氏染色法鉴别颈部和踝部索沟处皮肤组织的生活反应能力。牛文有等[8]报道了一种改良Poley’s 酸性复红-甲基绿染色法在鉴别生前与死后索沟时，比Mallory’s三色法和绪方氏染色法效果更好，尤其是高度腐败尸体，其鉴别能力更好。而IHC 染色与特殊染色技术联合使用在鉴别生前伤与死后伤方面更具优势。国外有学者[9]报道了1 例被发现死于垃圾运输车内的流浪汉，为鉴别死者的真正死因，法医病理学家提取多处损伤头皮组织进行HE、Van Gieson（VG）及分化群（clusters of differentiation，CD）15 染色，尽管在损伤区没有发现纤维素渗出和中性粒细胞聚集，但发现P-选择素在损伤区小血管内皮细胞质膜上呈中度表达，E-选择素无表达。VAN DER LAAN 等[10]发现，P-选择素在生理条件下表达于血管内皮细胞杆状细胞器Weibel-Palade小体膜上，在外伤或感染等条件下受组胺及凝血酶等刺激，迅速转移表达于内皮细胞质膜上（1～2 min开始表达、10～15 min 达峰值，2～4 h 逐渐消失），并招募中性粒细胞聚集；而E-选择素仅在外伤或受白介素（interleukin，IL）-1、肿瘤坏死因子-α 或脂多糖刺激后1～2 h 开始合成、4～6 h 达峰值，并于8～10 h 完全消失。

1.2 皮肤损伤时间推断

皮肤损伤愈合是一个复杂、规律的过程，包括炎症期、增殖期和重塑期[11]，应用IHC 染色技术检测上述过程中的生物活性物质，如胶原蛋白、炎症因子、细胞因子、生长因子等时程性表达，可用于皮肤损伤时间推断[12]。在20 世纪80 年代，EISENMENGER 等[13]应用IHC 染色技术检测损伤区及周边区皮肤组织不同类型胶原纤维的表达，用于皮肤损伤时间推断。国内法医学者亦采用IHC 染色技术在人体皮肤损伤时间推断方面进行了系列研究。王慧君等[14]收集15 例交通事故伤和刀刺伤人体皮肤标本，IHC 染色发现，损伤皮肤组织中均表达转化生长因子-β、碱性成纤维细胞生长因子和血管内皮生长因子，并总结前人研究成果[15]，提出多种细胞因子联合检测有助于人体皮肤损伤早期时间推断。官大威等[16]收集了52 例刺、切创人体皮肤标本，经IHC 染色发现损伤区皮肤组织中性粒细胞、单核细胞及成纤维细胞中均表达IL-8，且具有时程性变化规律，因此，IL-8 可作为人体皮肤损伤时间推断的候选指标。刘宁国等[17]在动物实验研究的基础上，成功研制出纤维连接蛋白-EIIIA 金标单克隆抗体试纸条，并初步应用于人体皮肤损伤时间推断。KONDO[12]总结了皮肤损伤时间推断的研究成果，认为参与皮肤损伤愈合过程的各类生物活性物质如胶原蛋白、纤维蛋白、黏附分子、炎症因子、趋化因子、血管生成因子、转化生长因子、应激蛋白、细胞增殖相关蛋白、类花生酸类物质等都可能成为皮肤损伤时间推断的候选指标，并建议利用IHC 染色技术系统研究多种类型细胞及多指标时程性变化规律用于人体皮肤损伤时间推断。

1.3 TDRS 损伤时间推断

TDRS 系脾中央型破裂和包膜下破裂发展而形成的真性破裂，常在伤后有一段较长时间的无典型症状和体征的“间歇”期，因此，TDRS 损伤时间推断是确定脾破裂与外伤之间因果关系的关键依据[1]。万阳等[18]对118 例人体外伤性脾破裂标本进行IHC 染色，检测损伤中央区及周边区髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）、CD68 和α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）的表达，发现伤后5 d 内均有MPO 表达且于伤后12～24 h 达高峰，伤后6～14 d 均有CD68 表达且于伤后5～7 d 达高峰，伤后1～14 d 均有α-SMA 表达且于伤后14 d 达高峰。因此，采用多指标IHC 染色并结合脾破裂组织病理学变化有助于人脾破裂损伤时间的精确推断。国外有学者收集了80例钝性脾破裂人体标本[19]，根据损伤周围组织纤维蛋白原（fibrinogen，FIB）、CD61 及CD68 的IHC 染色结果，将外伤性脾破裂划分为伤后1～3 d、4～10 d、11～16 d 和17～30 d 4 个时间阶段，用于外伤性脾破裂损伤时间推断。张富源等[20]在1 例TDRS 损伤时间推断的案例中，联合运用HE、Mallory 及IHC 染色技术，发现Mallory 染色较HE 染色可更清晰地观察到紫色条索状纤维素样物（新鲜出血区）与蓝染胶原纤维（陈旧出血区），且陈旧出血区较新鲜出血区可表达更多的α-SMA，从而确定同时存在急性（12～24 h）与迟发性（8～14 d）脾破裂，为TDRS 损伤时间推断的精准鉴定提供了病理学依据。

1.4 血栓形成时间推断

在鉴定损伤后因肺动脉血栓栓塞症（pulmonary thromboembolism，PTE）死亡的案例中[21]，法医病理学家需要研究血栓栓子的形成时间，从而分析损伤与血栓栓塞发生之间的时间顺序，进而分析损伤与死亡之间的因果关系。FINESCHI 等[22]对140 例PTE 死亡案例进行回顾性研究，经对血栓组织切片进行HE、Masson、磷钨酸苏木精（phosphotungstic acid-hematoxylin,PATH）、VG、Von Kossa 和Perl’s 等染色，以 及FIB、CD61、CD45、CD15、CD68 等IHC 染色，将血栓形成时间划分为3 个阶段，即伤后1～7 d、2～8 周和2 个月以上，并在后期收集的43 例PTE 死亡案例中得到了进一步验证[23]。国内法医学者[24]亦应用上述3 阶段分期标准对23 例PTE 死亡案例分析，发现血栓形成时间与外伤发生时间基本一致。王林林等[21]总结前人对血栓形成时间推断的研究成果并收集了相关法医学实践案例，结合IHC 和特殊染色结果，建议将血栓形成时间划分为5阶段，即伤后1～3 d、4～7 d、2～4周、5周～2 个月和2 个月以上，以利于血栓形成时间的精准推断。

1.5 TBI 及SDH形成时间推断

TBI 后损伤时间推断是法医损伤病理学研究的重点与难点[1]。笔者前期收集了TBI 人体标本[25-26]，经IHC 染色发现胶质纤维酸性蛋白、增殖细胞核抗原及可溶性蛋白100 均呈单峰表达，且上述指标的联合使用有助于TBI 后损伤时间的推断。HAUSMANN 等[27]收集104 例人体TBI 标本，对波形蛋白、肌腱蛋白及α-抗胰蛋白酶进行IHC 染色，并应用于TBI 后损伤时间推断。周亦武等[28-30]研究发现，热休克蛋白70、神经丝蛋白200 及细胞周期素D1 于TBI 后呈时程性变化表达，推测上述指标可作为TBI 后损伤时间推断的参考指标。此外，众多学者对TBI 后细胞凋亡进行了系列研究[31-33]，并用于TBI 后损伤时间的推断。郭相伸等[34]通过免疫荧光双重染色技术发现TBI 后核因子E2 相关因子2（nuclear factor erythroid derived 2-like 2，Nrf2）在神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞中均呈单峰表达，推测Nrf2 在多种类型神经细胞的时程性表达有望为TBI 后损伤时间推断提供新的参考指标。

SDH 多由外伤造成，分急性（3 d 以内）、亚急性（3 d～3 周）及慢性（3 周以上），其中非急性（亚急性和慢性）SDH 常在伤后一段时间才出现临床症状，因此判断非急性SDH 与外伤之间的因果关系是法医学鉴定的难点[1]。VAN DEN BOS 等[35]在总结前人研究成果的基础上，扩大SDH 样本量，联合使用HE、IHC 及特殊染色技术，总结SDH 后24 h 到1 年的组织病理学变化特点，以期对SDH 形成时间进行精准推断。

2 损伤并发症鉴定

损伤并发症[1]是指机体在原发性外伤的转归过程中发生的与原发性外伤之间存在直接因果关系的不良后果，其中脂肪栓塞、挤压综合征和骨筋膜室综合征的鉴别与诊断可以通过IHC 和特殊染色进行辅助诊断。

2.1 脂肪栓塞

脂肪栓塞分为创伤性和非创伤性。创伤性脂肪栓塞[1，36-37]常见于严重外伤（如长骨骨折）、脂肪组织丰富的软组织严重挫伤、大面积烧伤等，伤后短时间内肺、脑、心等多器官微血管内出现脂肪滴并堵塞管腔，严重时可因脂肪栓塞综合征（fat embolism syndrome，FES）死亡。在常规HE 染色切片制作过程中，因脂肪栓子被有机溶剂溶解，显微镜下肺组织细小动脉管腔内可见大小不等的空泡，尤其是肺泡壁毛细血管呈串珠样改变，但HE 染色无法明确血管内空泡的性质。因此，对怀疑因脂肪栓塞导致死亡的案件进行鉴定时，应提取肺、脑、心等组织制作冰冻切片，进行苏丹Ⅲ、油红O 及猩红染色，当在血管内发现亮橙黄色至红色小球，可为脂肪栓塞鉴定提供直接证据[1，38]。周兰等[38]利用油红O 染色对20 例因FES 死亡的案例进行回顾性研究时，发现18 例为单纯肺脂肪栓塞、2 例为肺脂肪栓塞合并脑脂肪栓塞。叶光华等[39]报道1 例因隆胸手术并发FES 死亡的案例，死者生前曾通过抽吸臀部皮下脂肪颗粒注射到乳房皮下组织内，HE 染色在死者肺动脉细小分支内观察到大量空泡，苏丹Ⅲ染色证实为脂肪栓子，进一步检查发现死者左侧乳房针孔附近小静脉破裂伴周围大量游离脂肪颗粒形成，从而证明了死因与隆胸手术之间的关系。

2.2 挤压综合征和骨筋膜室综合征

挤压综合征是指人体躯干、四肢等肌肉丰富的部位遭受严重挤压解除后，全身微循环障碍，肾小球滤过率降低，肾小管受阻、变性、坏死，出现以肌红蛋白尿和急性肾衰竭为主要特征的临床综合征[1]，法医学鉴定主要依据原发性软组织损伤及肾组织特征性组织病理学检验所见。HE 染色发现肾小管蛋白管型，IHC 染色证明为肌红蛋白（myoglobin，Mb），可作为诊断挤压综合征的直接证据[1]。高彩荣等[40]对15 例确诊为挤压综合征死亡的案例进行回顾性研究，发现所有死亡均发生于伤后36 h～6 d，HE 染色均观察到肾小管坏死及蛋白管型，IHC 染色证明其中13 例有肾小管Mb 管型。

骨筋膜室综合征（osteofascial compartment syndrome，OCS）常并发于挤压伤、药物滥用、手术固定不当、低位坠落，甚至蛇咬伤等引起的横纹肌溶解综合征[41-42]，亦可引起肌红蛋白尿和急性肾衰竭，甚至死亡。王涛等[42]曾报道1 例成年男性从0.8 m 高工作台上坠落致其右下肢疼痛并于4 d 后死亡的案例，尸体检验时发现其右下肢骨骼肌及软组织广泛肿胀、呈紫黑色伴大量血性液体渗出，HE 染色观察到肌肉广泛坏死伴大量中性粒细胞和单核巨噬细胞浸润，肾小管内发现大量均质蛋白管型，IHC 染色证明为Mb 管型，且死后血液中尿素氮和肌酐呈数倍升高，从而鉴定死者符合低位坠落致右下肢OCS 引起代谢功能紊乱并发急性肾功能衰竭死亡。

3 蛇咬伤和胰岛素他杀鉴定

IHC 染色技术还常用于蛇咬伤、胰岛素他杀案件的法医学鉴定。蛇毒的毒性成分主要是具有酶活性的蛋白质和多肽，且不同种类的蛇毒毒性成分的抗原特异性不同[43]，因此，可利用IHC 染色技术对蛇毒中毒及毒蛇种类进行鉴别。赵枢泉等[44]报道了1 例老年女性在睡眠中被蛇咬伤，2 d 后死亡的案例。尸体检验发现死者右外踝有3 处疑似毒蛇牙痕的点状出血伴周围软组织肿胀，HE 染色提示皮下胶原组织及肌肉凝固性坏死、出血并伴有以中性粒细胞为主的炎症细胞浸润，IHC 染色发现上述损伤区蝮蛇蛇毒蛋白呈阳性表达，从而认定死者系蝮蛇咬伤中毒死亡。胰岛素过量使用可引起低血糖昏迷、休克甚至死亡，而利用胰岛素进行谋杀常因注射部位隐蔽或尸体高度腐败使案件侦破处于困境。有研究[45]表明，利用IHC染色技术在疑似注射针痕周围皮肤组织中检测到胰岛素或胰岛素佐剂如鱼精蛋白，可作为胰岛素注射死亡的关键证据。杨怡等[45]报道1 例水中尸体死因鉴别的案例，在死者左上臂及左手背发现两处疑似出血点，经IHC 染色发现出血部位皮下软组织中含有胰岛素及鱼精蛋白成分，综合案情认定死者系胰岛素他杀后抛尸入水。

4 不足与展望

IHC 及特殊染色技术在法医损伤病理学实践中的应用广泛，并起到了越来越重要的作用。然而，IHC 和特殊染色技术在法医损伤病理学实践中的应用还存在以下不足：（1）大多数特殊染色技术的染色机制尚不明确，染色剂与组织细胞之间可能是物理性结合，也可能是化学性结合，在一定程度上影响了特殊染色技术的应用及发展；（2）对于IHC 染色技术，抗原成分的破坏或抗体的非特异性结合都会影响染色结果，从而造成假阴性或假阳性的判断；（3）本文综述的研究成果多为回顾性研究和案例报道，尤其是在损伤时间推断方面，其影响因素较多，如个体差异（年龄、性别、疾病）、损伤后治疗、死后变化等，缺乏系统性的评价，影响损伤时间推断结果的可靠性和准确性。

随着组织病理学技术的发展，全自动IHC 和特殊染色机在组织病理学检验中逐渐普及，与传统的人工染色相比，全自动染色机具有良好而稳定的染色结果、自动高效的工作流程，因此更具优势，值得推广。在此基础上，建议采用多指标、多细胞类型、人工智能、优化的统计方法，以及联合应用分子生物学技术、组学技术、光谱学和（或）质谱学成像技术等[2]，以利于IHC 和特殊染色技术在法医损伤病理学实践中的精准应用。