4种外用婴幼儿湿疹方剂安全性研究

吴白芬，尚 李，尚 怡，何芳雁，浦仕彪，周志宏，刘 录

(云南中医药大学 云南省高校中药饮片工程研究中心，云南 昆明 650500)

对于婴儿湿疹，局部外用糖皮质激素仍然是多个国际指南的一线治疗方案[1]，其强大的抗炎及免疫抑制作用可迅速控制病情，但停药后易复发，且长期使用后存在局部毛细血管扩张、皮肤变薄、色素沉着，甚至萎缩等不良反应，易并发感染.较成人而言，婴幼儿皮肤柔嫩，对药物吸收更强，同时婴幼儿湿疹的皮损范围广，常需大面积用药，对药物的安全性有更高的要求.基于激素、抗组胺药等常规治疗依从性差、副作用大、复发率高的现状，且临床上反复发作、迁延日久的难治性婴儿湿疹日渐增多，迫切需要寻找更安全、有效的治疗手段.中医药在婴儿湿疹治疗方面积累了丰富经验，其外治法更显示独特优势.本研究采用小鼠急性毒性、日本大耳白兔皮肤刺激性和豚鼠皮肤过敏性试验，对4种临床外用于婴幼儿湿疹的验方进行安全性评价，以期为进一步推广应用提供安全性依据.

1 试验材料

1.1 实验动物

ICR小鼠，5～6周龄，体重18～21 g，雌雄各半，生产许可证：SCXK(川)2015-030S.普通级豚鼠，体重220～400 g，雌雄各半；普通级日本大耳白兔，体重2.8～3.5 kg，雌雄各半，生产许可证：SCXK(滇)K 2018-0001.动物使用许可证：SYXK(滇)2018-0005.

1.2 受试样品

方剂1(1#)，由显齿蛇葡萄、桑白皮及三七等组成；方剂2(2#)，由显齿蛇葡萄、桑白皮及全蝎等组成；方剂3(3#)，由白鲜皮、紫草及全蝎等组成；方剂4(4#)，由显齿蛇葡萄、白鲜皮、紫草、桑白皮、三七及全蝎等组成.取各处方药材，分别加水煎煮3次，合并滤液浓缩至含生药浓度依次为0.84、0.80、0.80、1.04 g/mL(因为浓缩成浸膏也要配制成液体供灌胃用，这样做的话即可节能又能节省时间.)，4～8 ℃ 冷藏备用.儿肤康搽剂，成都森科制药有限公司(170807))；2,4-二硝基氟苯(DNFB)，中国上海试剂一厂(2003-07-01).

1.3 统计软件

采用SPSS17软件，计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析法；方差齐采用LSD法检验，方差不齐采用Tamhane′s法检验.

2 方法

2.1 急性毒性试验[2]

为提高体内暴露水平，特采用口服途径的最大耐受量试验考察系列方剂的急性毒性.试验时，选取禁食不禁水 8 h 后体重为18～21 g 小鼠120只，雌雄各半，按性别和体重随机分为6组，每组雌雄各10只，见表5.各组动物分别按 40 mL/kg(小鼠最大灌胃给药体积就是 40 mL/kg)容积灌胃给予纯水、儿肤康搽剂及各方剂样品原液(原液含生药浓度为 1.04 g/mL)，间隔 6 h 后再按同等剂量灌胃给药1次.观察各组动物给药后的急性毒性反应，主要毒性观测终点包括：死亡/濒死观察、临床观察和体重，并对所有存活动物于观察期末(15 d)进行解剖，肉眼检查各组织和脏器的体积、颜色、质地等有无异常，如有异常应及时取材进行组织病理学检查.

2.2 皮肤过敏性试验[3]

选245～400 g 普通级豚鼠60只，按性别和体重分为6组：阴性对照组(纯水)、阳性对照组(DNFB，1%为致敏浓度，0.1%为激发浓度)和各方剂样品原液组，每组10只，雌雄各半.每次致敏前 24 h 给各只豚鼠背部脱毛 3 cm×3 cm，并保持脱毛区皮肤完整.在试验第0、7、14天，将纯水、1% DNFB及各方剂样品原液分别涂抹于各组动物的脱毛区皮肤，给药量均为 0.2 mL/只，并用滤纸、保鲜膜、薄纱布覆盖固定，以保证药物与皮肤接触 6 h 后，温水冲洗去除剩余药物.试验第 28 d(末次给药后 14 d)，再次同法分别涂抹各种药物于豚鼠脱毛区皮肤进行激发，观察给药后6、24、48、72 h 的皮肤过敏反应情况，并按表1评分、按表2计算发生率.

表1 皮肤过敏反应程度的评分标准[3]

表2 皮肤致敏性评价标准

表3 皮肤刺激性反应评分标准

表4 皮肤刺激强度评价标准

2.3 皮肤刺激性试验[3]

采用同体自身对比法，将2.77～3.43 kg 日本大耳白兔8只分为完整皮肤及破损皮肤组，每组4只，雌雄各半.试验前对日本大耳白兔背部去毛，范围各 20 cm×15 cm.将完整皮肤组和破损皮肤组的背部皮肤均分为5块：上、左中、右中、左下、右下.破损皮肤组用灭菌手术刀片在5块皮肤上各划一个“井”字形创口，范围 2 cm×2 cm，以轻度渗血为度.

各组均取 0.5 mL 纯水涂于去毛区上部；1#样品原液 0.5 mL 涂于去毛区左中部；2#样品原液 0.5 mL 涂于去毛区右中部；3#样品原液 0.5 mL 涂于去毛区左下部;4#样品原液 0.5 mL 涂于去毛区右下部.涂药后以纱布覆盖，用无刺激性胶布加以固定，分笼饲养，保持药物贴敷时间 4 h 后，用温水清洁给药部位.连续 7 d 重复以上操作，视情况对给药部位进行重复脱毛.每次给药前及去除药物后 1 h，以及末次贴敷去除药物后1、24、48、72 h，观察并记录涂敷部位皮肤有无红斑和水肿等情况；按表3评分标准计算每一观察时间点各组积分均值及观察期内每天每只动物刺激积分均值，并按表4进行刺激强度评价.观察结束后颈动脉放血处死动物，取给药部位皮肤进行组织病理学检查.

3 结果

3.1 急性毒性

由表5可见，每日选用10只不同性别小鼠，小鼠一日内以 40 mL/kg 的最大容积间隔 6 h、2次灌服儿肤康搽剂及各方剂样品原液，各组动物在给药后 4 h 均有药样粪便排泄，疑似腹泻，其中儿肤康组于给药次日死亡雄性动物1只，其余各组均无明显毒性反应和死亡.在连续 14 d 的观察期内，各组小鼠体重持续增长，除儿肤康搽剂组及1#、2#、3#、4#样品原液雄性动物于给药后1、3 d 的体重增长明显低于对照组外，其余各组在各时间点的体重增长与对照组相比无明显差异.对观察期结束处死动物的尸检亦未发现组织或脏器有明显异常.研究结果表明，4种方剂样品原液的最大耐受量为 80 mL/kg(小鼠 1 d 内以 40 mL/kg 的最大容积间隔 6 h、2次)，口服均无急性毒性.

表5 小鼠灌胃途径最大耐受量试验体重变化

3.2 皮肤过敏性

3.2.1 试验期间纯水对照、阳性对照和4种方剂样品

原液组动物进食、行为活动及精神状态良好；各组动物体重均有增长，除阳性对照组后期体重增长有缓慢趋势外，其余各给药组与阴性对照组相比无显著差异，每组均选用10只豚鼠，详见表6.

表6 豚鼠皮肤过敏试验体重变化

3.2.2 致敏评价

空白性对照及各方剂样品原液给药组在激发后6、24、48、72 h 的观察点均未见皮肤红斑和水肿发生，致敏率为0；阳性对照组所有动物在相应观察点均有不同程度的皮肤水肿或红斑出现，致敏率为100%.4种方剂样品原液与豚鼠皮肤接触无致敏性，详见表7.

表7 豚鼠皮肤过敏试验评分结果

3.3 皮肤刺激性

3.3.1 一般状况

4种方剂样品原液和纯水对照连续 7 d 涂皮给药，完整皮肤和破损皮肤给药组日本大耳白兔体重均有增加，2组日本大耳白兔处死前的体重及给药前体重比较，均无统计学意义，每组选用4只白兔,详见表8.

表8 对日本大耳白兔体重的影响

3.3.2 肉眼观察

日本大耳白兔完整皮肤刺激性试验评分结果显示各动物各受试时间节点的在各受试部位刺激性评分均为0，再据表9可见，4种方剂样原液连续 7 d 涂皮给药，完整皮肤组各给药部位均未见明显红斑和水肿；各样品对破损皮肤组给药部位均有少数动物出现轻微的红斑或水肿，但反应平均分值均低于0.49；按表4“皮肤刺激强度评价标准”，4种方剂样品原液与皮肤接触给药对破损皮肤和完整皮肤均无刺激性.

表9 日本大耳白兔破损皮肤刺激性试验评分表

续表9

3.3.3 组织病理学观察

各方剂样品原液和纯水对照的日本大耳白兔破损皮肤和完整皮肤均可见表皮轻度增厚，真皮乳头层中多量以淋巴细胞、中性粒细胞为主的间质浸润.各给药部位与纯水部位相比，组织学改变的发生率及程度基本相当.破损皮肤组结果见表10和图1.如图1所示，图像采集使用10倍物镜时，纯水(a)和2#(c)、3#(d)、4#(e)样品中皮肤真皮乳头层可见少量淋巴细胞浸润；1#(b)样品真皮乳头层偶见淋巴细胞浸润.完整皮肤组结果见表11和图2.如图2所示，在10倍物镜下，纯水(a),1#(b),2#(c),4#(e)样品皮肤真皮乳头层偶见淋巴细胞浸润，3#(d)样品皮肤局部表皮表皮角化不全，真皮乳头层少量以淋巴细胞为主浸润，表明4种方剂样品原液与皮肤接触给药对破损皮肤和完整皮肤均无刺激性.

表10 主要病理改变汇总表(破损皮肤组)

图1 破损皮肤组

表11 主要病理改变汇总表(完整皮肤组)

图2 完整皮肤组

4 讨论与小结

中医药在治疗婴儿湿疹方面积累了丰富而又独到的经验.中医将婴儿湿疹归属于“奶癣”“胎敛疮”的范畴，认为婴儿湿疹系因禀赋不耐，脾胃运化失职，内有胎火湿热，外受风湿热邪而致[4].治疗上应清热解毒、健脾利湿、祛风止痒，其方法可分为中药内服法、皮肤外治法、哺乳期母子同治法、中药灌肠法等.由于婴儿服药不便，外治法更显示独特优势.婴儿皮肤角质层薄，有利于药物吸收，而湿疹病位表浅、病灶外露，外治药物不仅可以直达病所，通过透达腠理、疏畅经脉、调和气血、驱邪扶正等机制而发挥局部直接的治疗作用，还能通过肌腠毛窍，深入脏腑，起到内外合治的作用[5].

1#方由显齿蛇葡萄、桑白皮和三七三味药材组成；2#方由显齿蛇葡萄、桑白皮和全蝎三味药材组成.其中1#、2#方中显齿蛇葡萄均作为方中君药，具有清热解毒、消痈散结的功效，民间外用治疗脚丫湿疹及临床治疗小儿湿疹及化脓性皮肤病疗效确切[6-8]；臣药均为桑白皮取其利水消肿的功效[9]，1#方佐以三七活血化瘀、消肿止痛[10-12].1#方诸药合用，可达到清热燥湿、解毒敛疮的效果，具有消炎、抗菌、抗过敏作用，对渗出性皮肤病有收敛、消炎、止痒之功效；2#方佐以全蝎通络搜风[13-14].2#方诸药合用，起清热解毒、消肿祛湿之功.

3#方由白鲜皮、紫草、全蝎三味药材组成.白鲜皮作为方中君药，具有清热燥湿、祛风解毒的功效，是中医皮肤科治疗皮肤瘙痒特效药，多用于湿热证如湿疹、风疹、疮毒、黄水淋漓等[15-17]；臣药紫草善治各种皮肤疾病，方中取其凉血活血、清热解毒之功[18-20]；佐以全蝎加强通络搜风、攻毒解毒之功[13-14].诸药合用，共奏清热燥湿、止痒祛风之功.4#方由显齿蛇葡萄、白鲜皮、紫草、桑白皮、三七、全蝎六味药材组成.诸药合用，共奏清热燥湿、活血解毒及祛风止痒的功效.

尽管糖皮质激素对婴幼儿湿疹短期疗效肯定，但不能根治及停药后可引起皮损加重或激素依赖性皮炎，尤其是大范围大剂量用药还会导致垂体-下丘脑-肾上腺轴抑制或儿童生长发育迟缓的严重不良反应[21].多数家长因担心“激素药物毒副作用”而选择形形色色的“祖传秘方”、“民间验方”或者医疗机构方剂，但这类药物大多没有经过系统的安全性评价，给婴幼儿安全用药带来潜在风险.本研究对4种婴幼儿湿疹外用方剂进行安全性评价，结果表明：各方剂样品经小鼠按最大给药量灌胃未见明显急性毒性；经豚鼠皮肤给药未见过敏反应；对日本大耳白兔连续 7 d 涂皮给药无刺激性.本研究表明4种方剂外用给药均具有较高的安全性，结合深入的药物有效性研究，有望发掘出更好的婴幼儿湿疹外用制剂.