干细胞源外泌体及改良外泌体在治疗急性心肌梗死中的研究进展

胡悦,何洁琼,陈军

(1.广东医科大学，广东 湛江 524023；2.广东医科大学深圳宝安临床医学院 深圳市宝安区人民医院心血管内科，广东 深圳 518101)

急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)指冠状动脉急性闭塞、血流中断引起的局部心肌缺血性坏死，是威胁人类健康的重大疾病。2018年中国心血管病报告显示，我国AMI患者的死亡率自2005年开始呈快速上升趋势[1]，随着人们生活节奏的加快以及不良生活方式(加班熬夜、抽烟喝酒、高脂高热量饮食等)的影响，AMI发病呈年轻化趋势[2]。目前AMI的预防和治疗已成为重要的公共卫生问题。目前临床上AMI的治疗包括溶栓、冠状动脉内支架置入术、冠状动脉旁路移植术以及药物治疗，上述治疗均可改善症状，但部分患者的疗效不佳。研究表明，干细胞可增殖分化为心肌细胞，并替代受损心肌细胞，进而改善心脏功能，其中外泌体发挥重要的调节作用；通过包膜表面的特异性受体将细胞内的蛋白质和核酸转运至受体细胞，有望实现疾病的精准治疗[3-4]。现对干细胞源外泌体治疗AMI的机制以及改良外泌体治疗AMI的研究进展予以综述。

1 外泌体

1.1外泌体的形成 活细胞能分泌多种膜状囊泡，根据直径和生成机制不同可分为外泌体(直径40～100 nm)、微囊泡(直径200～1 000 nm)和凋亡小体(直径500～5 000 nm)[5]。外泌体是细胞通过内吞作用形成初级内体，初级内体再将细胞质中的信使RNA(messenger RNA，mRNA)、微RNA(microRNA，miRNA)、蛋白质及脂质等物质包裹在其中形成多泡晚期内体，然后多泡晚期内体与细胞膜融合通过胞吐作用将携带的蛋白质、基因和酶等物质释放到细胞外所形成的膜状囊泡，其广泛存在于血液、尿液、唾液、腹水等体液中[6-7]。

1.2外泌体的生物学特性 外泌体是细胞间进行信息交流的枢纽[6]，其生物学特性为：①靶向性。不同细胞来源的外泌体表面表达特定的跨膜蛋白(CD63、CD9、CD81、热激蛋白70等)，可靶向作用到特定的细胞[8]。②特异性。不同生理、病理状态下分泌的外泌体会分泌特定的miRNA、mRNA、蛋白质和脂质，其中miRNA是高度保守的小分子非编码单链RNA，与靶mRNA 3′非编码区互补结合，通过降解mRNA或抑制蛋白质翻译实现基因调控[9]，外泌体可通过这些特定的内含物向靶细胞传递相应的信号。③稳定性。外泌体具有双层膜结构，可避开循环系统中RNA酶的降解，具有高度的生物稳定性[10]。④低毒性和低免疫原性[11]。外泌体属于非细胞体系，具有低毒性和低免疫原性，可避免发生排斥反应，有利于外泌体作为载体向靶细胞传递信息。

2 外泌体治疗AMI的作用

当冠状动脉管腔发生急性完全闭塞时，其所供区域的心室壁心肌会出现透壁性坏死，临床表现为典型的ST段抬高型心肌梗死，冠状动脉闭塞后20～30 min，其供血心肌有少量坏死，1～2 h后绝大部分心肌呈凝固性坏死，坏死组织1～2周后开始吸收并逐渐纤维化，6～8周后进入慢性期形成瘢痕愈合，较大瘢痕处可逐渐外凸出形成室壁瘤，波及心内膜可导致附壁血栓形成，波及心包会出现反应性心包炎[12]。在心腔压力作用下，坏死的心室壁可破裂，造成心包积血而引起猝死。虽然传统治疗(溶栓、冠状动脉内支架置入术、药物治疗等)可暂时改善患者症状，但部分患者仍遗留较多并发症，最终导致慢性心力衰竭。

干细胞具有多向分化特性，目前广泛用于心肌梗死后心脏再生治疗。干细胞疗法虽然可明显改善心脏功能，但易产生排斥反应和致畸作用[13]。移植细胞的旁分泌因子——外泌体可能在受损心肌细胞的修复过程中起主要作用，而非移植细胞本身。Zhao等[14]发现，人脐带间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)可通过抗凋亡、促进细胞增殖和血管生成修复受损的心肌细胞，促进心脏功能恢复，而无外泌体的人脐带MSC几乎不能促进心脏功能恢复。提示人脐带MSC对心肌细胞的修复是由外泌体介导的。外泌体本身具有低毒性和低免疫原性，可降低免疫排斥反应，弥补干细胞移植的缺陷。Suzuki等[15]的研究发现，外泌体主要通过抗凋亡、抗纤维化、抗炎、促进内皮细胞增殖和血管生成等几个方面修复AMI后的心肌细胞。

2.1抗凋亡作用 细胞凋亡指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主有序的死亡。心肌梗死区域心肌细胞凋亡率明显升高，心肌缺血、缺氧等均可诱导心肌细胞凋亡[16]，心肌细胞的进行性丧失最终会导致心力衰竭，因此抑制早期心肌梗死中的心肌细胞凋亡对改善心脏功能、预防心室重塑和减少心血管事件非常重要，并且是治疗心肌梗死的重要方法之一。外泌体作为细胞间信息传递的媒介，可与靶细胞结合，调控细胞凋亡，改善心肌预后。有研究发现，外泌体miR-133可抑制细胞凋亡，输注miR-133过表达MSC心肌梗死大鼠的梗死心肌面积缩小[17]，推测外泌体miR-133可通过抑制细胞凋亡改善心脏功能，缩小心肌梗死面积。Zhang等[18]研究发现，在低氧环境下，骨髓MSC外泌体可通过上调miRNA-24抑制心肌细胞凋亡，进而减少心肌梗死面积。Dai等[19]的研究显示，外泌体miRNA-379可通过调节肿瘤坏死因子-α诱导蛋白8，降低心肌细胞凋亡水平，保护心肌细胞免受AMI诱导的心肌损伤。另有研究表明，脂肪干细胞分泌的miR-214具有抗细胞凋亡作用，AMI时心肌细胞通过网格蛋白介导的内吞作用捕获miR-214，导致心肌损伤，而氯丙嗪可抑制网格蛋白介导的内吞作用，降低心肌细胞凋亡[20]，这一研究成果为AMI的治疗提供了新的方法。

2.2抗纤维化作用 心肌纤维化是心肌梗死后的主要病理过程，梗死后的心肌细胞在1～2周后逐渐纤维化，损伤组织由纤维化瘢痕取代，但过度的纤维化会改变心室顺应性，增加心室壁厚度，影响心脏的收缩和舒张，严重者可导致心力衰竭[21]。研究显示，心脏成纤维细胞与心肌细胞之间存在联系，心肌缺血再灌注损伤时，心脏成纤维细胞会分泌富含miR-423-3p的外泌体，外泌体作为重要的旁分泌信号转导介质，将miR-423-3p运送到心肌细胞中，通过影响下游效应因子Ras相关小鸟苷三磷酸酶蛋白超家族介导对心脏的保护作用[22]。目前抑制心肌过度纤维化是治疗心肌梗死的理想方法，其中外泌体起重要作用。Luo等[23]通过建立大鼠心肌梗死模型和低氧诱导下心肌损伤体外模型研究miR-126过表达的脂肪干细胞源外泌体对损伤心肌细胞的作用，体外结果显示，miR-126过表达的脂肪干细胞可降低心肌细胞纤维化相关蛋白的表达；体内研究证实，注入富含miR-126的外泌体大鼠心肌梗死模型的心脏纤维化和炎症细胞因子的表达显著降低，梗死后的心肌损伤面积也显著缩小[23]。另外，转化生长因子-β1在调节心脏成纤维细胞分化和胶原代谢中起关键作用，其可通过增加细胞外基质沉积以及胶原蛋白和纤连蛋白的合成，促进心肌纤维化，过表达可能导致心功能障碍[24]。Yu等[25]研究发现，外泌体miR-133a的过表达可降低心肌梗死后转化生长因子-β1的水平，减少心肌胶原蛋白沉积，抑制心肌纤维化，改善心脏功能。

2.3抗炎作用 AMI时心肌缺血缺氧可诱导机体产生细胞因子和趋化因子，促使中性粒细胞和单核细胞在梗死区域聚集，进而产生炎症反应，导致心脏功能受损。白细胞介素-10是天然存在的抗炎细胞因子，参与抗炎、增殖、抗凋亡等过程[26]。Yue等[27]研究发现，白细胞介素-10缺陷型心肌梗死小鼠心肌坏死加重，梗死面积增加，中性粒细胞浸润增多。经白细胞介素-10治疗后，炎症反应减轻，成纤维细胞活化增强，心肌重构改善。进一步研究证实，白细胞介素-10缺乏时可通过上调外泌体中的整合素连接激酶以及激活受体细胞中整合素连接激酶介导的核因子κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)通路促进炎症反应；当外泌体中的整合素连接激酶表达降低时，炎症反应减轻[27]，进而减少心肌损伤。Liu等[28]的研究表明，富含miR-93-5p的外泌体可通过靶向作用Toll样受体4，抑制细胞凋亡和炎症因子的表达，减轻心肌损伤。Yuan等[29]发现，miR-145-5p可通过负调节CD40减轻缺氧诱导的细胞炎症反应，从而在心肌缺血性损伤中起心脏保护作用。还有研究表明，心肌梗死后小鼠miR-155的表达增加，其中miR-155主要存在于巨噬细胞中，巨噬细胞分泌的外泌体可将miR-155转移到心脏成纤维细胞中，抑制心脏成纤维细胞增殖并促进成纤维细胞炎症反应，而miR-155抑制剂可抑制此作用，降低炎症反应和心脏破裂的发生率，并显著改善心脏功能[30]。由此得出，miR-155抑制剂具有作为减轻AMI相关不良事件治疗剂的潜力，这一研究成果也大大提高了利用外泌体修复缺血性心肌的可能性。

2.4内皮细胞增殖和血管生成作用 心肌梗死后心肌供血不足导致部分心肌细胞缺氧坏死，进而出现心肌细胞肥大和收缩力减弱，而新生血管增多可重新恢复心肌细胞氧供，增加冠状动脉血流，减少心肌梗死面积，保护心脏功能。有研究发现，心肌梗死后循环系统中的外泌体及携带的基因选择性地转移到外周器官，并优先转移到骨髓[31]。转移的miRNA通过下调骨髓细胞中趋化因子受体4的表达，动员祖细胞促进内皮细胞增殖及血管生成。Ju等[32]向心肌梗死小鼠注入MSC源外泌体发现，MSC外泌体可促进心肌细胞增殖和血管生成，缩小梗死面积。Kang等[33]研究发现，脂肪干细胞分泌的miR-31也可促进血管生成，主要是通过抑制缺氧诱导因子1抑制因子发挥作用，缺氧诱导因子1是血管内皮生长因子的转录活化因子，通过转录活化编码血管内皮生长因子的基因，促进血管新生[34-35]。还有研究表明，间充质细胞分泌的miR-125a和miR-30b可通过抑制血管生成抑制剂δ样4的表达促进内皮细胞增生和血管生成[36-37]。以上研究表明外泌体可通过促进内皮细胞增殖和血管生成改善心脏功能，缩小心肌梗死面积。

3 改良外泌体在AMI治疗方面的研究

干细胞源外泌体作为非细胞体系，被认为是治疗心血管疾病的一种潜在方法。随着研究的深入发现，外泌体与MSC移植联合、外泌体加载物质或通过药物阻断吞噬系统对外泌体的内吞作用，可显著提高外泌体改善心肌损伤的作用。

已有研究证明，基质细胞衍生因子-1(stromal cell derived factor-1，SDF-1)及其受体趋化因子受体4在干细胞移植到缺血性心肌组织中发挥重要的促进作用，SDF-1表达在局部心肌缺血性损伤后1～3 d达到峰值[38]。然而，SDF-1表达升高时如果存在急性炎症反应和高氧化应激反应会严重影响移植细胞的存活[39]。Huang等[40]的研究发现，外泌体可通过增加SDF-1的表达及降低炎症反应提高MSC的存活率，该研究先将外泌体递送到心肌，然后再将MSC移植到梗死心肌，与单独使用外泌体或MSC治疗的对照组相比，可显著改善心脏功能，增加新血管形成并减少梗死面积。研究显示，AMI后30 min向心肌内注射外泌体，并在AMI后第3天联合MSC移植治疗可最大程度地改善心脏功能[40]。外泌体和MSC移植联合治疗AMI不仅为外泌体的临床应用奠定了基础，也为AMI的治疗开辟了新道路。

当外泌体最大程度地作用于AMI心脏时才能充分发挥作用。为提高MSC源外泌体对心脏的靶向性，Wang等[41]将缺血性心肌靶向肽基序CSTSMLKAC装载到外泌体表面，使其靶向作用于缺血性心肌细胞，结果发现，载有缺血性心肌靶向肽的外泌体作用于缺血性心肌细胞的数量较空白外泌体显著增多；并证实在心肌梗死小鼠中MSC衍生的缺血性心肌靶向肽外泌体可显著抑制炎症反应和心肌细胞凋亡、增强血管生成、缩小心肌梗死面积并改善心脏功能[41]。Vandergriff等[42]的研究显示，心脏归巢肽与外泌体结合可增加心脏外泌体的含量，进而增强外泌体对心肌损伤的修复作用。Kim等[43]通过在外泌体膜上表达心脏靶向肽的基因修饰，显著增加了外泌体的心脏递送。以上研究显示，外泌体与靶向肽的结合可显著提高心脏组织中外泌体的含量，增强外泌体对心脏的保护作用。

外泌体具有特异性、靶向性和稳定性，但其在体内的运输仍受到多种因素的干扰，如单核吞噬细胞系统对外泌体的内吞作用阻碍外泌体到达相应靶器官(包括心脏)。有研究发现，输注到动物体内的外泌体优先聚集在肝脏和脾脏，主要是因为这两个器官存在大量的巨噬细胞[44]。网格蛋白重链作为一种由CLTC基因编码的蛋白质,在巨噬细胞中高表达，并介导巨噬细胞发挥内吞作用。Wan等[45]采用两步外泌体递送策略，先向阿霉素诱导的心肌毒性模型输注网格蛋白重链抑制剂(如氯丙嗪)，显著阻断脾脏和肝脏中单核吞噬细胞系统的内吞作用，再注入装载miR-21的外泌体，与未输注网格蛋白重链抑制剂组相比，装载miR-21的外泌体对心肌的保护作用显著增强。通过阻止单核吞噬细胞系统对外泌体的摄取，再递送治疗性外泌体的策略是一种有前途的治疗方法。外泌体在体内移植后的低保留率也是临床的一大难题。有研究显示，用功能性肽水凝胶封装外泌体后植入大鼠梗死心肌可增加外泌体的保留率和稳定性，显著改善心肌功能[46]。另外，将超声微泡与外泌体同时输注到小鼠体内，然后在心脏组织中特异性诱导超声靶向微泡破坏，结果显示外泌体在心脏组织中的含量显著增加[47]。这项研究强调了超声靶向微泡破坏技术促进外泌体运输到心脏的潜力，此方法有望成为一种新的AMI治疗方式。

4 结 语

外泌体近年备受关注，其膜表面有靶向信号，具有较强的器官特异性，可用于疾病的靶向治疗。干细胞源外泌体可通过抗凋亡、抗炎、抗纤维化、促进血管生成等作用修复心肌细胞、缩小心肌梗死面积、改善心脏功能，改良后的外泌体可显著提高其对心脏的保护作用。目前外泌体在心血管治疗方面的研究还处于起步阶段，其内容物的作用及其介导信息传递通路的作用仍有待进一步探究。另外，外泌体的分离需大量原材料且产出不高，未来还需进一步研究外泌体的分离提纯技术。尽管在动物实验和细胞实验方面外泌体治疗AMI的研究取得了一定的进展，但如何应用于临床还需要深入研究。