牛结核病诊断方法及在疫病净化中的应用

肖颖 赵明

（1，重庆市动物疫病预防控制中心 401120；2，山东省青岛市动物疫病预防控制中心 266100）

牛结核病（Bovine tuberculosis,bTB）是由牛分枝杆菌（Mycobacterium bovis）引起的一种人和动物的慢性细菌性传染病，OIE 将其列为必须报告的动物疫病，我国将其列为二类动物疫病。据估计，全球结核病潜伏感染约占总人口的1/3，发展为临床活动结核的比例约为5%～10%。在发展中国家，10%以上的人结核病是由牛分枝杆菌引起的[1]。据我国兽医公报显示，2020 年全国共发生牛结核病疫情115 起，发病761 例，扑杀261 例，累计疫情最多的省份依次为内蒙古自治区、新疆维吾尔自治区和陕西省。牛结核病呈现宿主范围广、感染基数大、发病数相对较少的特点，给该病的防控乃至净化造成困扰。本文主要从牛分枝杆菌病原与流行病学特点、检测方法及其在发达国家牛结核净化根除中的应用进行综述。

1 病原学特点

牛结核病主要由牛分枝杆菌（牛型）、山羊分枝杆菌（山羊型）引起，结核分枝杆菌（人型）也可致病。牛分枝杆菌属于严格需氧菌，革兰氏阳性菌，长约1.5～4μm、宽0.2～0.5μm 的细长弯曲杆菌，没有鞭毛，无运动性，不形成芽孢和荚膜[2]。细胞壁含有较高的类脂和腊脂，脂质含量约占干重的60%，耐干燥，对热的抵抗力较差，60℃30min，80℃5min 即可灭活。对一般消毒剂抵抗力较强，对湿热、酒精及紫外线相对敏感。

2 流行病学特点

牛结核病一年四季均可发生。宿主范围广泛，约50 多种哺乳动物及25 种禽类可感染本病。在家畜中，奶牛易感性最高，其次是黄牛和水牛。发病动物尤其是开放性结核病动物是主要传染源，通过唾液、鼻液、痰液和生殖道分泌物等排出体外。该病主要经呼吸道传播，牛、人及野生动物等通过吸入含有病原菌的飞沫而感染。该病还可通过消化道传播，易感动物采食了被污染的饲料、草、饮水等感染。饲养管理良好通风可有效控制牛结核病患病率。研究发现，结核病人饲养的牛患牛结核病的比率比健康人饲养的牛高2 倍[2]，放牧饲养模式牛结核病患病率为1%～5%，圈养模式动物结核患病率可达25%～50%，排菌病人家中牛结核病患病率较痰菌阴性病人饲养牛患病率高70%，较不活动结核病病人家庭牛高4 倍[3]。

因致病菌感染部位不同病例表现形式也不同，如肺结核、乳房结核、肠结核、淋巴结核和神经结核等。其中以肺结核最为常见，主要表现为进行性消瘦、咳嗽和呼吸困难；乳房结核表现为泌乳量减少或停止，泌乳稀薄并可通过乳汁引起小牛感染；肠结核可引起肠道系膜淋巴结炎，腹泻和便秘交替出现，多见于犊牛；淋巴结核会引起附近淋巴结肿大；神经结核常出现神经症状。

3 主要诊断方法

3.1 细菌学方法

主要包括涂片染色法、细菌培养法、分枝杆菌生长指示管法（MGIT）等。涂片染色法通常采用萋尼染色或荧光抗酸染色法检查抗酸性杆菌，需解剖后无菌采集病变明显组织器官如肺脏、淋巴结、肝脏等进行涂片。该方法只能检出抗酸杆菌，不能准确对结核分枝杆菌及其他非典型分枝杆菌进行鉴定，并且40%～60%的病例和75%的其他结核病例不能被检出[4]。细菌培养法是结核病诊断的金标准，牛分枝杆菌对营养要求高，生长缓慢，需要14～15h 分裂一次，一般需要4～8 周时间，对标本采集和样品前处理都有相应要求，临床分离成功率通常较低[5]。传统的固体培养基如罗氏培养基、丙酮酸钠培养基，制作简单，价格低廉，但培养时间较长。罗氏培养基甘油含量超过0.75%，对刚分离出的牛分枝杆菌有抑制作用，并且初代培养菌落不容易处理，而丙酮酸钠培养基初代培养后菌落为团型，操作性强。液体培养基如：7H9、MB/BACTALERT 3D 和BACTEC MGIT 960 等，液体培养基含有复杂的营养成分，添加了细菌抑制剂，在分离培养时间、阳性率和污染率方面优于固体培养基，但检测成本较高[6]。牛分枝杆菌在培养过程中存在污染率高、耗时长、阳性率低的缺点，不适合推广。

3.2 迟发型过敏反应试验

结核菌素皮内变态反应（TST）是国际贸易指定的检测方法，1890 年Koch 研制出了结核菌素，该方法至今已使用了130 年，至今仍是主要的牛结核病检测方法之一。初期牛结核的诊断是采用结核菌素点眼的办法，根据牛眼充血程度进行结核阴阳性判断。但该方法对牛刺激较大，后来改为皮试方法[3]。该方法在结核病早期具有检测优势，因为在感染初期，细胞免疫水平比体液免疫反应更容易被检测到。皮试法可进一步分为尾褶结核菌素皮内检测（CFT）、颈部单一结核菌素皮内试验（SICT）及比较结核菌素皮内试验（SICCT）。有试验表明，SICT 阳性率高于SICCT，阳性符合率为27.27%；CFT 阳性率低于SICT，符合率可达69.39%[7]。对于环境中副结核分枝杆菌污染较严重的区域，适合选择比较皮试法进行检测。该方法的优点是便于在基层推广、成本低，但缺点是特异性差，感染后3～6 周内易出现假阴性。易与非结核分枝杆菌（NTM）发生交叉反应出现假阳性结果，且需要间隔72h 才能测量皮厚，劳动强度大、主观判断性强、不适合所有易感动物的检测，检测发病后期病情严重的牛易出现假阴性结果。

3.3 γ-干扰素检测方法

γ-干扰素试验作为牛结核病检测的补充试验，需要采集抗凝全血，用结核菌素（牛结核菌素、禽结核菌素）平行刺激外周血淋巴细胞，由于免疫记忆，阳性牛会释放大量的IFN-γ，且IFN-γ 产生的量和检测样本中结核菌素含量呈正相关。因此，可通过对比释放出的IFN-γ 含量来判定。目前，我国已制定γ-干扰素检测方法国家标准，可作为牛结核病的早期诊断方法。但结核菌素皮内变态反应试验与γ-干扰素试验在检测结果上存在不一致性。研究发现，部分个体IFN-γ 方法结果为阳性而皮试法结果呈阴性，采用皮试法对阴性个体持续进行跟踪监测观察，20 个月后，86%的个体陆续转为皮试阳性[8]。IFN-γ 检测方法的优势在于在个体感染极低剂量下，只要外周淋巴细胞释放较微量的IFN-γ 即可检测到，且读取结果较皮试法客观。但缺点是检测成本高，操作复杂，采集的全血需尽快运到实验室进行结核菌素刺激，通常需要有经验的实验室人员进行操作。研究发现，在皮内变态反应实验后8～28d 内再进行IFN-γ 检测，其灵敏度和特异性没有显著影响[9]。因此，IFN-γ 检测实验可以配合皮内变态实验进行牛结核病平行试验和系列试验。

3.4 ELISA 抗体检测方法

ELISA 抗体检测方法是牛结核病诊断辅助手段中唯一的血清学检测方法，可作为TST 的补充方法。牛分枝杆菌生长缓慢，在感染的不同阶段会分泌不同的蛋白质，主要用于血清学反应抗原有CFP10、MPB70、MPB164、ESAT-6、MPB83 及LPSO 等。CFP-10 和ESAT-6 蛋白属于早期分泌性抗原，单独应用，两者特异性均为100%，但敏感性较低。将两种蛋白混合使用不但能保持高特异性，且大大提高了敏感性，甚至超过PPD 的敏感性，同时还可以对卡介苗免疫牛和自然感染牛进行鉴别诊断[10]。MPB70 是牛结核病重要的体液免疫和细胞免疫靶抗原，单独应用MPB70 建立的ELISA 方法，特异性可达98%，而敏感性仅为21%[11]。将MPB70、MPB83 和ESAT-6抗原融合表达建立的MA-ELISA 方法，特异性可达96%，敏感性为69.4%，明显高于MPB70、MPB83 和ESAT-6 单独表达所建立方法的敏感性[12]。提示多抗体联合应用可极大提高血清学诊断的敏感性[13]。感染晚期牛体内存在高循环抗体，此时细胞免疫受到抑制，TST 可能出现假阴性，比较适合用ELISA 抗体检测方法。鹿抗体反应发展的较早，运用比较ELISA 检测敏感性较高[14]，ELISA 可以用作对野生动物（如鹿等）的辅助检测方法。在牛分枝杆菌感染动物体上存在变态反应叠加现象，皮内变态反应2～8 周，更利于ELISA 检测[15]。ELISA 方法可作为TST 皮试的补充方法及对“无反应性个体”的替代方法，进一步发现和淘汰阳性牛，确保牛群健康[16]。

3.5 分子生物学检测方法

随着分子生物学技术的发展，PCR、巢氏PCR、荧光定量和核酸探针等方法应用到牛结核病病原学诊断中。1989 年聚合酶链反应首先应用在人结核病检测中。IS6110 是结核分枝杆菌中一个多拷贝的保守片段，以该序列设计引物扩增靶序列，特异性强和灵敏性高，广泛用于人结核病PCR 检测。IS6110 在人结核分离株中拷贝数较高，但在大多数牛分枝杆菌分离株中只有1 个拷贝[17]。而插入序列IS1081 在人型和牛型分枝杆菌中有5～6 个拷贝，并未在其他分枝杆菌中发现该序列[18]。因此，以IS6110 和IS1081 等结核杆菌插入序列作为扩增靶点进行PCR 检测，在牛结核病诊断、分型和流行病学调查中具有重要意义[19]。针对插入序列IS6110 基因片段设计一对引物，6h 可完成整个检测过程，最低核酸检测量为1.025pg/uL[20]。建立的FQ-PCR 检测方法，针对插入序列IS1081 序列设计的荧光定量PCR 引物和探针，敏感性达到10 个拷贝[21]。检测牛结核菌recA-IS6110-IS1081 三重PCR 检测方法，敏感性达到585、19.5 和19.5fg，可作为牛分枝杆菌和结核分枝杆菌的快速检测和流行病学调查工具[22]。

4 检测方法在牛结核净化根除中的应用

4.1 常用检测方法实际应用比较

TST 和IFN-γ 检测方法适合牛结核病的早期诊断，而ELISA 血清学检测方法在病情后期、感染严重时期具有检测优势。一般皮内变态反应要求牛结核菌素注射剂量为2000IU 单位，但在结核病净化和根除时，OIE 推荐使用5000IU 单位，注射剂量不得大于0.2ml。虽然目前制定了皮内变态反应标准操作方法，但结核菌素抗原标准化尚未统一[23]。比较SICT 和SICCT 两种检测方式，SICT 敏感性更高，适合在牛结核病流行地区可增加感染牛检出。SICCT 在控制或稳定地区更有利于开展检测净化[24]。通过ELISA 和TST 对比试验，对TST 检测呈阴性的牛进行跟踪监测，并采用组织病理学和PCR 方法验证，发现阴性牛中83.7%感染了牛分枝杆菌。ELISA 可作为TST 的补充试验，来改善奶牛的健康[16]。以TST 试验为标准，比较了IFN-γ、ELISA、SICTT 在污染场临床检出效果，发现IFN-γ 方法阳性检出率显著高于SICCT 检出率，而ELISA 敏感性显著低于TST 试验[25]。牛结核病阳性率较高的牧场可选用SICT、IFN-γ 方法单独或者联合使用来增加阳性检出率。目前尚无商品试剂盒可以进行牛潜伏感染和活动性结核的鉴别诊断。

4.2 发达国家牛结核病防控主要监测方法

成功控制和根除了牛结核病的发达国家在控制过程中都遵循了“检疫-扑杀”相结合的综合防控措施，选择了合适的监测体系，通过立法进行保障来加快净化进程。在净化成功经验中，皮试法发挥了重要作用。如爱尔兰采用单一皮试方法每年对所有牛群进行监测；美国、加拿大、澳大利亚及欧洲许多国家采用皮试法和IFN-γ 联合使用的方法；澳大利亚在早期根除牛结核病监测中采用单一皮试法，提高牛结核菌素剂量，在后期引入IFN-γ 方法后开始进行联合试验，这样既增加了阳性牛的检出，又保证了阴性牛的健康，欧洲大部分国家首先用TST进行普查，对高风险地区采用平行试验，提高敏感性增加阳性牛的检出，对低风险区域采用系列试验，提高特异性避免错杀；也有使用TST 和ELISA 方法相结合的办法，如韩国在后期采用ELISA 抗体和IFN-γ 方法进行牛结核病根除。英国的野生动物獾、美国的鹿、新西兰的负鼠等都因野生储存宿主的存在给牛结核病的根除造成了一定的阻碍。当前，德国、澳大利亚、荷兰等国家获得了欧盟“无结核”的认可，日本、美国、法国等国家牛结核病已得到控制，目前尚无任何国家通过OIE 无结核病认可。

4.3 我国牛结核病防控主要措施

我国牛结核病的防控中主要采取以“监测、检疫、扑杀和消毒”相结合的综合性防治措施。因地制宜、分类指导、因场施策、逐步净化，积极开展场群和区域净化工作。目前对牛结核病没有疫苗预防，不进行药物治疗，在牛结核病净化群中（包括犊牛群）检出阳性牛时应及时扑杀。基层检测手段主要依赖SICT 和SICCT，有条件的实验室选用IFN-γ 方法进行监测。近年来，我国开始推进布鲁氏菌病和牛结核病净化场和示范县创建，以养殖场和县为单位极大地推动了我国牛结核病净化进程。

5 展望

目前，我国多个省份均有牛结核病发生的报道，野生动物感染情况不详，部分县存在牛结核病检疫积极性不高，养殖场户主动检疫意识不强和对牛结核病净化不了解、没有意愿的情况。据2015～2018 年我国部分地区牛结核病流行病学调查显示，只有60.17%的养殖场户进行了PPD-TST 检疫，其中67.61%场户每年检疫一次[26]。有研究学者对SICT 阳性牛用细菌学方法进行鉴定，25.9%样品分离到抗酸阳性菌，18.5%样品分离到分枝杆菌，仅有1.9%的样品分离到牛分枝杆菌[24]。部分PPD-TST 检测阳性牛，未见典型结核症状，剖检仅有少数发现结核病变。因此，在净化过程中，应采用一种以上的检测方法加以验证，同时加强对屠宰环节检疫，探索更加合理的无害化处理方式，减少资源浪费。

目前，牛结核诊断的各种方法可能适合疫病进展的一个阶段，但不一定适用于其他阶段。开发适用于基层推广的敏感性高、特异性强、耗时短的鉴别诊断方法，对潜伏感染和活动性结核鉴别诊断方法。探索扑杀活动性牛结核阳性牛，对潜伏感染牛持续隔离跟踪观察，既可节省扑杀成本，又提高养殖场户对牛结核病净化的支持，对牛结核病的防控具有积极意义。