CRISPR/Cas9在自身免疫性疾病中的应用

陈振宇

（福建师范大学生命科学学院，福建 福州 350117）

免疫反应被抗原激活后，在消灭抗原的同时，甚至当抗原已被清除后，激活的淋巴细胞凋亡延迟，且将自身组织当作靶抗原予以杀伤，产生自身免疫性疾病。自身免疫性疾病临床表现多样，发病机理未明，尚缺乏理想治疗方法。临床治疗方案除控制发病诱因外，主要采用抑制或阻断体内病理性自身免疫应答方法，如激素类药物、抗风湿药物、免疫抑制剂等，但这些药物无法彻底根治。随着以CRISPR/Cas9为代表的基因编辑技术的崛起，许多疾病有望通过基因治疗让患者获得痊愈，而且近年来与自身免疫相关的基因，细胞因子和信号通路相继被发现，这为治疗自身免疫性疾病提供了很多新的思路。

1 CRISPR/CAS9系统简述

1.1 CRISPR/CAS9的发现

早期，研究者们认为像细菌和古细菌这样的单细胞生物只有简单的免疫防御机制，而缺乏“记住”病原体的能力。然而，Ishino等[1]发现在大肠杆菌的碱性磷酸酶基因编码区下游存在一段由长度为29 bp的重复片段和32～33 bp的非重复片段间隔相连的重复序列，之后的研究发现这种重复结构在细菌和古细菌中普遍存在[2]。21世纪初，该结构被正式定义为Clustered regulatory interspaced short palindromic repeats(CRISPR)。CRISPR/Cas系统类似于真核生物的适应性免疫系统，能够“记住”之前攻击过细菌的病原体，并在病原体再次攻击宿主时迅速建立有效的反应，清除病原体[3]。在CRISPR/Cas发现后不久，科学家开始使用各种CRISPR/Cas系统进行实验性基因改造，并最终用于基因治疗，如今，CRISPR/Cas被认为是开发针对疾病（如癌症、单基因疾病和自身免疫性疾病）分子疗法最有前途的工具之一[4]。

1.2 CRISPR/CAS9的结构

作为一种适应性免疫系统，CRISPR/Cas系统的存在使得原核生物可以“记住”那些来自病毒或者噬菌体的外源DNA，然后阻止这些DNA在原核生物体内的复制[5]，从而防止原核生物再次受到相同外源DNA的攻击，类似于真核生物中的RNAi系统[6]。2007年，在嗜热链球菌中首次发现CRISPR作为适应性免疫系统的证据，该项研究表明，CRISPR间隔区的序列与特定噬菌体基因组序列之间的序列同源性是CRISPR系统发挥作用的前提[7]。此外，又证明了新的间隔重复单位是在被噬菌体攻击之后获得的，并且cas基因转录的产物是CRISPR系统功能不可缺失的一部分。

一个典型的CRISPR/Cas基因序列由三个部分组成。分别是CRISPR序列，间隔重复序列以及cas基因序列。CRISPR序列在不同原核生物基因组中的数量可能有所不同，但每个CRISPR位点之前都含有一个富含AT的不保守的前导序列[8]，长度从几个碱基对到一百个碱基对不等。该序列对于CRISPR的转录至关重要，缺乏前导序列的CRISPR片段没有显示出能够获得新的间隔重复单位的能力[9]。

CRISPR 序列的第二部分是由间隔重复序列组成，每个单位都有一个间隔重复序列，在不同的物种、菌株，甚至在同一基因组的不同位点之间都有所不同，其后紧连着一个与病毒基因组中原间隔序列相同的间隔序列。每个序列重复间隔单元的数量从几个到几百个不等，目前已知的最高数量的重复间隔单元是氯氟烃属植物基因组中的374个[10]。

cas 基因构成了CRISPR基因序列的第三部分。这些基因通常位于重复序列之后，并增加了CRISPR系统的可变性，因为每个基因集群都有不同的cas基因集。迄今为止，已鉴定出40多个cas基因家族，其中六个cas基因家族存在于几乎所有具有CRISPR序列（Cas1至Cas6）的物种中，因此被称为“核心”cas基因。

1.3 CRISPR/Cas9的作用机制

CRISPR 功能分为三个阶段：适应、CRISPR RNA的形成和干扰。在第一阶段，当外源DNA入侵细菌时，其CRISPR系统会特异性地捕获一段被称为proto-spacers的外源DNA序列插入到前导序列与间隔重复序列之间，并进行一次重复片段的复制，形成一段新的重复单元，这些重复单元就是细菌特异性免疫的结构基础。值得注意的是，外源DNA的捕获并不是完全随机的，在这些被捕获的DNA序列下游通常有一段序列保守的特殊结构，被称为PAM位点[11]。PAM位点的存在可能是CRISPR系统区分自身DNA与外源DNA而避免发生自身免疫的机制之一[12]，同时也是基因编辑时靶序列选择的重要需求[13]。在第二阶段，形成的重复单元会被转录形成前体CRISPRRNA(Pre-crRNA)，在RNAseⅢ的作用下成熟。成熟的crRNA与tracrRNA通过碱基配对形成双链RNA结构，Cas9蛋白结合形成靶向切割复合体对外源DNA进行特异切割，达到识别和降解外源DNA的目的。

2 CRISPR/Cas9技术在自身免疫性疾病中的应用

2.1 CRISPR/Cas9用于筛选自身免疫性疾病调控基因

CPISPR/Cas9 有望用于治疗单基因疾病和大多数自身炎症性疾病。自身免疫性疾病的遗传背景复杂，多基因多通路参与发病机制，且易受外部环境的影响，CRISPR/Cas技术诱导基因失活已经在多个研究领域得到应用。

有研究表明Treg细胞的不稳定则会促进自身免疫或更多更有效的抗肿瘤免疫，其主要特征表现为主要转录因子Foxp3的缺失及促炎性特性的获得。在一项研究中，研究人员开发出了一种用于初级小鼠Treg细胞表型研究的基于CRISPR的联合筛选平台，同时研究人员利用该技术对大约500个核内因子进行了靶向功能缺失的筛选分析，从而识别出能促进或干扰Foxp3表达的基因调节程序[14]。此外，有研究团队使用CRISPR全基因组筛选技术，在T1D（1型糖尿病）小鼠模型中利用自身免疫的选择性压力在自身免疫性糖尿病中进行无偏倚的全基因组搜索，以寻找胰岛β细胞存活的修饰因子[15]。

许多遗传变异与自身耐受性的丧失及自身免疫的发展有关。研究发现在一些自身免疫性疾病患者的样本中发现了数百种遗传变异，其中约90%存在于非编码区和免疫增强子[16]。具有顺式调节和表观遗传特征的非编码区的遗传调控受损是自身免疫性疾病的主要基础，证明这些变异是否是免疫功能的假定控制因子的一个潜在方法是使用CRISPR进行序列微干扰，该方法已被用于识别功能性非编码区[17]。这些区域中的一些序列作为增强子，可能对免疫调节至关重要，对特定的细胞外环境或刺激做出反应。基于CRISPR的实验也能用于识别这些重要的自身免疫风险基因座的调控序列，如CD69和IL2RA，后者与克罗恩病有关[18,19]。此外，CRISPR筛选也被用于PD-1和PD-L1的假定调节因子的研究[20]。

2.2 CRISPR/Cas9用于构建自身免疫性疾病模型

CRISPR 亦被运用于某些疾病模型的构建。例如，一组研究人员创建了家族性噬血细胞性淋巴组织细胞增生症2（FHL2）模型，以测试在无法进行骨髓移植时，与间充质基质细胞共同培养作为替代疗法的效果[21]。利用CRISPR对自身免疫调节因子基因（AIRE）也进行了研究，揭示了AIRE的干扰导致自身免疫的机制之一是通过破坏胸腺髓质上皮细胞（mTECs）与胸腺细胞之间的粘附[22]。

在另一项研究中[23]，研究人员运用CRISPR/Cas9技术制备了Trex1D18N/D18N点突变小鼠，该小鼠展现出了许多人类自身免疫的症状，包括生存时间显著下降，心脏、肾脏的多个器官受损，自身抗体增加等。利用CRISPR/Cas9技术建立的这些自身免疫性疾病模型对后续的药物开发和临床应用具有重要意义。

2.3 CRISPR/Cas9用于自身免疫性疾病治疗

有一些免疫系统的疾病是由单基因紊乱引起的，例如周期性发热综合征、原发性免疫缺陷和某些自身免疫性疾病等可以用CRISPR来进行治疗，这些疾病中的大多数都是由于生殖系中的基因变异引起的，使得造血干细胞能够产生基因变异的祖细胞和成熟细胞。因此，异基因干细胞移植通常是严重联合免疫缺陷（SCID）[24]或慢性肉芽肿性疾病的治疗方法，然而，时常发生移植物抗宿主的情况，可能会对预后产生负面影响。通过使用CRISPR，可以在患者自身的造血干细胞中进行基因修饰，插入正常的基因拷贝，然后产生自体移植的细胞库，可以在没有移植物抗宿主风险的情况下重建免疫系统的功能[25]。

类似的方法也被用于镰状细胞病。在一项研究中，来自HBB基因有纯合错义突变的SCD患者的iPSCs通过CRISPR与含有野生型HBB等位基因的DNA模板进行同源重组修饰，使得常规的β珠蛋白可以正常表达[26]。

在分化的免疫细胞也可以通过CRISPR进行突变纠正。IL2RA的隐性突变导致一个有自身免疫性疾病家族史的患者FOXP3 Tregs中IL2受体α链处于低水平状态，一项研究在利用CRISPR进行靶向修饰后，患者的T细胞开始表达正常水平的IL2RA[27]。

CRISPR 修饰的Tregs过继细胞疗法也是治疗自身免疫性疾病的方法之一。在模式动物中，类风湿性关节炎通过进行的Treg移植，显示出改善的迹象；然而，在人类RA患者中尝试这种方法之前，维持Treg的分化是一个重要的问题。CRISPR/Cas系统也被用于修饰可能影响FOXP3表达的基因，使得Treg的表型占优势，并促进了类风湿性关节炎过继Treg治疗的效果[28]。

另外一项最新的成果中，研究人员运用CRISPR/Cas9技术对A20进行了研究[29]，结果表明A20去泛素化酶（DUB）结构域的遗传变异增加了系统性红斑狼疮（SLE）和类风湿性关节炎的风险。A20由基因TNFAIP3进行编码，是NF-κB的负调节剂，DUB结构域可以通过结构变化来降低或增加NF-κB活性[30-32]，因此可以对NF-κB诱导的促炎和存活基因表达进行调节，但是有其他报道表明A20的DUB活性对其NF-κB抑制功能并不是必要的[33]。因此，由A20 DUB结构域的遗传破坏引起的自身免疫风险增加可能是由NF-κB途径以外的其他机制引起的。

利用CRISPR/Cas对表观遗传进行调控也被用于治疗自身免疫性疾病。Jing等人通过CRISPR/Cas序列干扰开发了一种具有miR-155表达沉默的巨噬细胞细胞系，在该细胞系中，促炎细胞因子的表达显著降低，这种方法可能是治疗类风湿性关节炎的一种途径[34]。生物药物的常规抗细胞因子治疗通常由于在非靶组织中的抑制而具有副作用。然而，使用CRISPR/Cas9，Brunger等人实现了生物药物的闭环生产。研究人员利用CRISPR/Cas9技术将IL1R拮抗剂和STNFR 1-鼠IgG的基因插入鼠iPSC CCL2基因的位点。在炎症过程中，CCL2表达对白细胞介素-1和肿瘤坏死因子-α的反应。当细胞暴露于炎症信号时，细胞因子拮抗剂的表达减轻了白细胞介素-1和肿瘤坏死因子α的体外病理生理效应[35]。

3 总结与展望

2020 年10月，瑞典皇家科学院宣布，将2020年诺贝尔化学奖授予Emmanuelle Charpentier和Jennifer A.Doudna，以表彰她们在“凭借开发基因组编辑方法”方面作出的贡献，意味着此项技术迎来了一个崭新的时代，它将会逐渐地渗入人类的日常生活和医疗健康，如可以用于提高部分农产品的抗病性和产量，不需要再利用杂交选种的方式。它为疾病建模、基因筛选以及基因沉默、插入、干细胞修饰和表观遗传修饰等领域提供了一种简单且廉价的方法，让科学家们在各自的领域有了新的方向和突破。虽然这项技术为科学研究提供了诸多便利，由于自身免疫性疾病多与遗传相关，且多基因多通路参与发病机制，CRISPR可能是通过使用针对自身免疫性疾病患者的个性化药物来实现疾病治愈的有力治疗手段之一，但需要注意的是单基因的敲除是否会影响机体其他功能的缺失或者导致其他疾病，所以对于CRISPR/Cas9在自身免疫性疾病中的应用还需要进一步深入研究，以利用此项技术的最大潜力来开发针对特定疾病的个性化治疗方法。