组织工程化神经导管治疗周围神经损伤

沈君劼 林俊卿 索金龙 鲍丙波 柴益民 郑宪友

周围神经损伤是指因创伤等造成的神经轴突中断或断裂，从而影响神经传导功能，导致患者出现躯干及四肢的感觉、运动功能及交感神经功能障碍，可严重影响患者生活质量[1]。针对周围神经损伤的治疗方式包括自体神经移植、神经移位修复、神经松解减压等。这些治疗方式各有优缺点，其中自体神经移植是临床治疗周围神经损伤的常用方法和“金标准”方法，但其仍存在一些不足之处，如供区损伤、移植物来源有限以及移植后神经粗细不匹配等。

近年，生物工程技术及组织工程化神经技术逐渐被应用于基础研究和临床治疗中。组织工程化神经即应用“支架材料-细胞-生长因子”复合物桥接神经缺损的断端，以达到修复缺损神经的解剖结构及功能连续性的目的[2]。本文就组织工程化神经中支架材料、种子细胞及生长因子的研究进展进行综述。

1 支架材料

支架材料是组织工程的核心要素，其要求具备以下性能：①良好的亲水性及生物相容性，以有利于种子细胞黏附并降低移植后的免疫排斥反应；②生物可降解性，以满足轴突再生速率与支架降解速率的匹配；③优良的机械性能，以避免外部组织压迫引起内壁坍塌，阻碍轴突再生[3]。目前，组织工程神经导管领域应用较多的支架材料包括可降解聚合材料、脱细胞材料及碳纳米材料。

1.1 可降解聚合材料

尽管早期研究证实不可降解导管也具有一定的周围神经修复作用，但残留材料引起的排异反应限制了其进一步应用。目前，组织工程神经导管的材料选择从应用人工或天然可降解材料到开发交联技术聚合人工/天然材料，已取得较大进展[4]。近年来常用天然材料包括蛋白质类(丝素、胶原等)和多糖类(明胶、壳聚糖、纤维素、藻酸盐等)，常用人工材料主要包括脂肪多元脂类、导电聚合物及水凝胶材料[5-8]。由于天然可降解材料具有优良的生物相容性、亲水性，而人工可降解材料能保证支架的可调机械性，因此复合支架构建是生物工程的发展趋势，并有望在组织工程神经领域获得广泛应用。

为进一步提升生物支架的综合性能，近年来对于可降解聚合材料开发的热点逐渐延伸到材料的化学改性以及3种以上材料的交联复合方面。Luo等[9]将明胶赋予甲基丙烯酸酐官能团，制备成甲基丙烯酰胺基明胶(GelMA)神经导管。他们开展的体外实验表明，该水凝胶三维结构更适合神经生长，并具有促血管再生和促神经干细胞定向分化的能力。Lopez-Silva等[10]将具有多肽结构的自组装水凝胶导管用于大鼠周围神经卡压模型治疗。他们发现，与对照组相比该水凝胶导管能明显加快神经纤维再髓鞘化和促进功能恢复。此外，也有学者提出使用乙酰化改性壳聚糖基导电复合材料。大鼠体内实验表明，该材料具有良好的生物相容性、导电性和可降解性[11]。以上研究表明，通过技术改性及材料的交联复合，可进一步提高可降解聚合材料在神经导管研究中的价值。

1.2 脱细胞材料

脱细胞材料去除细胞成分而保留了细胞外基质和大部分生长因子，其在降低免疫反应的同时可更接近自体神经的三维结构与功能，对神经再生具有极大应用价值。周围神经修复材料包括血管、肌肉、神经等[12-13]。Li等[14]在临床研究中使用人去细胞神经导管结合对侧C7神经移位术治疗臂丛神经损伤，通过4年随访发现治疗组的预后功能恢复更满意。由于同种来源脱细胞支架的来源有限，异种来源脱细胞支架的使用拓宽了其应用范围。近年文献报道的异种脱细胞材料来源包括大鼠、小鼠、兔、猪等[15]，它们均在体外实验中被证实有利于种子细胞黏附、增殖以及轴突再生。其中，猪来源异种脱细胞神经导管因其组织结构更接近人体，被认为最有望替代同种脱细胞支架。

1.3 碳纳米材料

石墨烯碳纳米材料具有良好的导电性和机械强度，在组织工程中有广阔的应用前景。过去数年，石墨烯纳米材料在周围神经损伤修复中的应用已取得很大进步。Huang等[16]将施万细胞孵育在石墨烯材料表面，发现其能通过电信号刺激促进细胞迁移增殖，并提高神经生长因子(NGF)的表达。由于周围神经损伤后轴突的定向再生需要借助施万细胞引导，上述发现为石墨烯材料的体内实验研究提供了理论支持。学者们进一步在体外实验中发现，石墨烯能诱导人多能干细胞[16]、大鼠骨髓间充质干细胞[17]、小鼠胚胎干细胞[18]等向神经谱系细胞分化发育，提示不同动物来源及人来源的干细胞移植到石墨烯材料后均能生存并分化。由于石墨烯材料亲水性较差、脆性较高，应用于体内研究常需和其他材料进行复合。有学者制备出石墨烯/聚L-丙交酯-己内酯(PLCL)神经导管，大幅提升了神经细胞的黏附、增殖能力，以及S100、NGF等神经蛋白的表达水平。有研究将该导管移植入大鼠10 mm坐骨神经长段缺损模型，结果显示复合石墨烯的导管在动作电位、神经传导速度和神经支配功能恢复上均优于PLCL导管[19]。Park等[20]则利用GelMA水凝胶复合氧化石墨烯制备出一种可导电神经导管，并显示出其对周围神经系统具有促进再生的效果。

虽然上述研究结果均提示石墨烯在修复神经损伤中的优越性，但石墨烯碳纳米材料难以在体内被降解吸收，具有潜在的生物毒性[21]。为解决这一问题，Qian等[22]通过改进制备方法，首次提出层层制模法制备单层和多层复合石墨烯神经导管。该导管的表面微孔有助于营养交换和代谢，并通过确定最佳石墨烯含量来降低体内的细胞毒性反应。近期有学者使用荧光素标记碳纳米材料，利用活体成像技术监测神经导管降解后石墨烯在体内的分布，这种方法为明确石墨烯碳纳米材料的体内生物毒性提供了新思路[23]。

2 种子细胞及其衍生物

种子细胞及其衍生物是组织工程的原材料之一，它们参与构建了组织工程化神经导管，同时也转化为生物组分，促进和引导轴突再生，为神经再生提供适宜的微环境。因此，种子细胞的合理应用成为组织工程化神经导管成功的关键要素。

2.1 施万细胞

施万细胞是周围神经损伤修复中极为重要的结构和效应细胞。损伤发生时，施万细胞可增殖并募集巨噬细胞来吞噬碎片，后期的轴突再生修复也需要施万细胞引导并分泌生长因子[24]。多项体内外实验证实，负载施万细胞的组织工程神经导管能上调NGF的表达，显著改善受损神经的形态和功能，并促进轴突再生[25]。虽然施万细胞作为种子细胞具有一定效应，但由于它是终末期细胞，增殖能力较差，提取较为困难，限制了其推广。有研究人员从大鼠皮肤组织中分离出施万前体细胞，并将其成功填充于神经导管，以促进新生轴突髓鞘化及运动功能的改善[26]。

2.2 干细胞

干细胞具有向神经元细胞和类施万细胞分化的潜能，被认为是组织工程学中的重要细胞。研究证实，神经导管结合诱导多能神经干细胞具有促进周围神经再生的能力，并且细胞移植的免疫原性较低[27]。但是考虑到细胞存活率、体外扩增难易度以及提取途径等问题，诱导其他组织来源干细胞向神经样细胞分化是目前的研究热点。大量体内外实验证实，骨髓、胚胎、毛囊、脂肪、肌肉等组织来源的干细胞均具有向神经细胞及神经胶质细胞分化的潜能，其修复周围神经损伤的效果优于单一神经导管，其中骨髓间充质干细胞和脂肪间充质干细胞目前应用最为广泛[28]。由于大部分研究缺少不同干细胞之间的比较，因此尚不能推断何种细胞是神经组织工程的最佳种子细胞。近期，有学者对相同支架负载骨髓间充质干细胞和脂肪间充质干细胞修复大鼠坐骨神经缺损进行比较研究。他们发现，负载脂肪间充质干细胞的支架细胞增殖速度更快，但再生神经纤维数目、再生神经纤维直径以及大鼠步态指数在两种支架间未见显著性差异，因此还需要开展更多对照研究，来比较不同种类干细胞在周围神经修复中的差异[28]。

值得注意的是，干细胞移植前的预处理阶段、宿主体内微环境变化均会对移植效果产生影响，导致最终分化的神经细胞数目不足[3]。有研究表明，支架移植入缺损神经后仅约5%的骨髓间充质干细胞能分化为类施万细胞[29]。因此，解决细胞移植后低存活率和低分化率问题是目前种子细胞研究的热点。Zhou等[30]为提升移植干细胞存活率，引入旋转细胞培养系统来提高植入细胞及生长因子的生物活性。Yurie等[31]利用3D打印技术将骨髓间充质干细胞作为生物墨水，结果显示制备过程加快，且仿生三维支架结构可提高种子细胞的生存能力。

近年，基于种子细胞的基因编辑技术为提高细胞移植后的修复效率提供了新策略。Sultan等[32]通过基因技术改造骨髓间充质干细胞使其具备分泌脑源性神经营养因子的能力，发现改造后的细胞能诱导神经细胞突触延伸，进而促进神经修复。

2.3 细胞外囊泡

外泌体是一种携带信使RNA、微RNA、长链非编码RNA、蛋白质等信息的纳米级细胞外囊泡。外泌体是重要的细胞间通讯工具，对周围神经损伤的发生发展和调控具有重要作用，正逐渐成为组织工程神经的研究热点[33]。学者们首先发现施万细胞外泌体能促进神经细胞迁移，将其移植入大鼠坐骨神经缺损模型后可显著促进轴突再生[34]。随后，Guo等[35]发现间充质干细胞来源外泌体修复周围神经损伤的能力与施万细胞外泌体在周围神经损伤中的修复效果相似。Rao等[36]将壳聚糖支架包裹人牙间充质干细胞来源外泌体，并将其移植入大鼠坐骨神经缺损处，移植12周后发现，与对照组相比，实验组再生神经纤维数目和神经纤维直径均明显增加，腓肠肌失神经支配现象明显减轻。上述研究表明，细胞外泌体能促进周围神经损伤后的再生，为组织工程神经提供了新方法。

3 细胞因子

周围神经损伤后内源性因子常无法满足神经再生的需求，因此神经导管缓释外源性细胞因子成为组织工程研究的又一方向。文献已报道的神经细胞因子包括NGF、神经营养因子(GDNF)、脑源性神经营养因子、睫状神经营养因子等[37]。Singh等[38]使用3D打印技术将NGF填充于组织工程神经导管，并将其移植入大鼠坐骨神经缺损模型。他们发现，NGF组不仅再生神经纤维结构更接近于正常神经组织，大鼠损伤后步态功能恢复也优于单纯支架组。Fadia等[39]在恒河猴上建立50 mm正中神经缺损模型，并将GDNF添加于聚已内酯(PCL)支架上，发现PCL/GDNF治疗组相比单纯PCL支架组能更显著地促进施万细胞定向迁移及轴突再生。近年来有学者尝试将多种细胞因子混合，以进一步提高组织工程神经的修复效率。Lu等[40]使用水凝胶支架包裹GDNF和血管生长因子，制备出双功能性神经导管。他们将该导管用于大鼠10 mm坐骨神经缺损模型中，发现双细胞因子组神经周围微血管新生更明显，同时体内电生理信号和神经纤维新生密度均强于单一使用两种细胞因子组。

这些体内外研究表明了细胞因子在组织工程神经中具有的潜能。此外，鉴于上述两种细胞因子组合后效果优于单细胞因子，也有学者直接使用富血小板血浆等含多种生长因子的组织成分复合支架材料来修复周围神经缺损，发现周围神经修复效果与自体神经移植接近[41]。由于细胞因子是大分子蛋白，易受支架材料制备时的高温高压或物理环境影响，所以组织工程神经制备过程中保持细胞因子活性也是今后研究的方向[37]。

4 存在问题与展望

周围神经再生解剖及生理功能的复杂性对组织工程神经导管提出了许多挑战。近年来，尽管支架材料、种子细胞和细胞因子在体内外实验中的应用均有显著突破，但仍然存在诸多问题亟待解决，如支架材料的降解速率、生物相容性、结构和制备方式的优化、种子细胞的来源及伦理、移植后存活率、移植剂量、扩增后宿主免疫反应、细胞因子移植量及生物活性的保持等。