外泌体对膝骨关节炎的影响及其治疗作用

李夏林 刘赫 易伟宏

骨关节炎是一种常见的关节退行性病变，通常是由于肥胖、劳损、创伤、畸形等因素引起的关节软骨退化及损伤，全球约有2.5亿人患病，而其中又以膝关节最易受累。膝骨关节炎常表现为关节疼痛、僵硬，打软腿，晚期易出现关节畸形、活动严重受限等症状。随着世界人口肥胖、老龄化等问题日益严重，膝骨关节炎发病率呈增高趋势。据统计，全世界60岁以上人口男性发病率约为10%，女性发病率约为13%，患者生活质量明显下降[1]。目前膝骨关节炎的治疗策略主要为阶梯治疗。膝骨关节炎早期可以通过理疗、功能锻炼、口服消炎止痛药、关节内注射皮质激素等治疗缓解症状[2]，改善生活质量。膝骨关节炎进展到晚期，关节软骨磨损严重，关节疼痛严重，并可出现关节畸形，此时只能通过膝关节置换术来缓解疼痛症状，矫正畸形，提高运动能力。目前尚无一种方法能逆转膝关节软骨退变病理过程，从而彻底治愈膝骨关节炎。

既往观点认为，膝骨关节炎始动因素主要为关节软骨损伤和退变。近年有研究表明，膝骨关节炎是由全关节组织退变及功能失衡造成，其中包括关节软骨损伤退变、关节滑膜炎症、软骨下骨重建、关节韧带和半月板退变，以及关节周围肌肉和神经等病理变化，它们均对膝骨关节炎发生发展产生影响[3]。而外泌体是一种由细胞分泌的有膜结构的特殊微小囊泡，它作为一种生物信号传递的中介，在细胞间进行信息传递，通过各种信号转导通路调控细胞功能[4]。近年来大量研究表明，不同组织来源的内生性外泌体在膝骨关节炎发生发展过程中起到重要作用，同时不同干细胞来源的外泌体对膝骨关节炎能起到保护和治疗的作用。

1 外泌体生物学特点

外泌体是一种由细胞分泌的特殊细胞外囊泡。细胞外囊泡包括凋亡小体(直径500 nm ～2 mm)、微泡(直径100～1 000 nm)及外泌体(直径30～150 nm)。有学者最早发现一种在成因、大小、成分等方面有独立特点的细胞外囊泡，于是将其单独分出来并定义为外泌体。外泌体直径为30～150 nm，含有mRNA、miRNA、lncRNA、circRNA等多种RNA分子，以及脂类、蛋白质、氨基酸等多种生物活性分子[5-6]。外泌体可通过其携带的这些生物活性大分子来调节受体细胞生物学活性，并参与细胞分化、迁移免疫应答、抗原提呈等方面的信号传递。

2 外泌体制备及鉴定

分离高纯度的外泌体是进行外泌体相关研究的关键步骤。目前外泌体分离方法有差速离心法、密度梯度离心法、过滤法、筛分分离法、免疫分离法、沉淀法等。每种方法都有自己的优势及不足，而其中差速离心法是外泌体分离最常用的技术之一。其步骤主要为低速离心去除细胞及细胞碎片，然后中速离心以去除较大的囊泡，最后高速离心沉淀外泌体。高速离心力一般介于100 000～150 000 ×g 之间，这种方法能分离出纯度较高的外泌体，缺点是其过程需要昂贵的高速离心机，同时高速离心也常会影响外泌体结构，从而可能影响实验结果[7]。

外泌体可以通过形态学分析、粒子大小分布及特异的结构蛋白分析等方面进行鉴定。透射电镜分辨率可达0.1～0.2 nm，非常适合外泌体双层囊膜超微结构的观测。纳米颗粒追踪分析技术则可以体现样本中所有外泌体的粒径分布情况，快速、精准地分析外泌体浓度粒径，为外泌体存在提供有力证据。而通过蛋白免疫印迹(Western Blot)、酶联免疫吸附测定法(ELISA)等技术则可以鉴定外泌体中的一些特殊标志性蛋白，如CD9、CD63、CD81、HSP90等，为外泌体进一步研究提供了有力的保障[8]。

3 不同组织来源外泌体对膝骨关节炎的影响

3.1 软骨细胞来源外泌体

软骨细胞是关节软骨组织中唯一的细胞种类，多项研究表明软骨细胞能分泌外泌体并对膝骨关节炎进展产生影响。Ni等[9]研究发现，骨关节炎患者关节软骨组织分泌的外泌体能促进巨噬细胞产生白细胞介素(IL)-1β，从而诱导炎症反应。Li等[10]研究发现，软骨细胞能分泌外泌体，从而促进骨髓间充质干细胞(BMSC)向软骨细胞分化，而其作用机制是外泌体中的miR-8485通过调控BMSC的Wnt/β-连环蛋白信号转导通路实现的。Chen等[11]研究发现，软骨细胞来源外泌体可以成功诱导软骨祖细胞在皮下分化成为软骨组织；体外实验也证实，该外泌体能在抑制血管生成的同时，促进软骨祖细胞成软骨分化，并使软骨形成特异性标志蛋白表达增加。这些研究结果表明，关节软骨细胞能分泌外泌体，软骨细胞来源外泌体可介导软骨细胞与靶细胞间的信号传导，并对膝骨关节炎病理过程产生重要影响。

3.2 关节滑膜组织来源外泌体

关节滑膜对于膝关节内稳态起了非常重要的作用。Kolhe等[12]在体外关节软骨细胞培养中加入骨关节炎患者关节液分离出的外泌体，发现软骨细胞合成代谢相关基因表达降低，而分解代谢相关基因表达增加。Domenis等[13]成功从膝关节病患者关节液中分离出外泌体，并发现它能促进M1型巨噬细胞释放前炎症因子。这提示关节液内的外泌体对骨关节炎进展起促进作用。Zhou等[14]对比骨关节炎患者及健康人关节液中外泌体组分，发现骨关节炎组外泌体中miRNA-126-3p表达明显下降，而miRNA-126-3p能促进软骨细胞分化和增殖，并抑制IL-1β、IL-6及肿瘤坏死因子(TNF)-α等炎症因子表达，同时抑制软骨细胞凋亡。

3.3 其他组织来源外泌体

肌腱是膝关节结构重要组成部分，其中肌腱干细胞也能产生外泌体，可能对膝骨关节炎产生影响。Wang等[15]研究发现，肌腱干细胞及其分泌的外泌体能抑制基质金属蛋白酶(MMP)-3及增加基质金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP)-3、Ⅰ型胶原蛋白α1表达，从而促进肌腱组织修复。Zhao等[16]用脂多糖预处理牙周韧带纤维母细胞，然后将其分离出的外泌体作用于MG-63成骨细胞，结果显示其可上调IL-6及TNF-α水平，并抑制骨保护素生成，从而导致炎症并抑制骨生成。因此，肌腱及韧带组织内产生的外泌体均可能对膝骨关节炎发生发展产生影响，但其具体作用机制仍需进一步研究。

4 间充质干细胞来源外泌体对膝骨关节炎的治疗作用

既往有众多研究表明BMSC或脂肪间充质干细胞(AMSC)能促进软骨细胞再生，有临床研究显示其治疗膝骨关节炎的疗效良好，但具体分子机制仍不十分清楚。越来越多的研究表明，间充质干细胞对骨关节炎的治疗作用主要来源于其旁分泌的作用，其中就包括外泌体[17]。近期有多项研究表明，不同组织来源的间充质干细胞来源外泌体对骨关节炎均有明确的治疗作用，它能减少软骨内炎症因子产生，促进软骨基质合成，并延缓骨关节炎进展[18-21]。

4.1 BMSC来源外泌体

BMSC来源外泌体能参与调节多项生理及病理过程，其中包括免疫反应、血管生成、骨形成等。有研究表明，BMSC来源外泌体能促进损伤组织如软骨组织及软骨下骨等修复。Cosenza等[22]研究发现，BMSC来源外泌体能诱导骨关节炎小鼠关节软骨细胞产生Ⅱ型胶原蛋白，并抑制炎症及分解代谢；体内实验也表明，BMSC来源外泌体对骨关节炎小鼠关节软骨有明显的保护作用。Qi等[23]研究发现，BMSC来源外泌体能被软骨细胞吞入，并抑制IL-1β诱导的线粒体膜电位异常及细胞凋亡。Dong等[24]研究发现，BMSC来源外泌体能抑制IL-1β诱导的软骨细胞损伤作用，这种保护作用是通过外泌体中miR-127-3p先抑制软骨细胞CDH11，而后抑制Wnt/β-连环蛋白信号转导通路完成的。Mao等[25]研究发现，高表达miR-92a-3p的 BMSC来源外泌体能通过抑制WNT5A表达促进软骨细胞增殖及软骨基质合成，活体实验也证实这种外泌体对骨关节炎小鼠模型关节软骨起到明显的保护作用。因此，通过调控BMSC来源外泌体分泌或通过基因修饰等手段调控外泌体内容物可增强其治疗膝骨关节炎的疗效，为以后膝骨关节炎治疗提供了很有前景的新方案。

4.2 滑膜间充质干细胞来源外泌体

许多研究表明，滑膜间充质干细胞(SMSC)来源外泌体也具有较强的促进软骨细胞分化能力。Zhu等[26]研究发现，人SMSC能促进软骨细胞增殖及迁徙；在胶原酶诱导的骨关节炎小鼠模型中，关节腔注射SMSC来源外泌体能明显延缓骨关节炎进展。Tao等[27]研究发现，SMSC来源外泌体能促进软骨细胞增殖及迁移，但是它会抑制细胞外基质生成，而高表达miR-140-5p的SMSC来源外泌体则能在促进软骨细胞增殖的同时，避免对细胞外基质生成的抑制。

4.3 AMSC来源外泌体

由于对膝骨关节炎患者行关节镜手术探查可以较容易地获取髌下脂肪组织并从中提取AMSC，故近年来用AMSC及从中提取的外泌体治疗膝骨关节炎的研究越来越多。Tofino-Vian等[28]研究发现，AMSC来源外泌体能下调衰老相关因子β-半乳糖苷酶活性，同时能抑制IL-6及前列腺素(PG)E2等炎性介质释放，因而对骨关节炎有保护作用。随后他们从腹部吸脂手术的患者脂肪中分离提取出AMSC来源外泌体，从骨关节炎患者中提取关节软骨细胞，将软骨细胞体外培养并添加IL-1β进行刺激，然后进行共培养，结果发现外泌体能明显减少TNF-α、IL-6、PGE2 及一氧化氮等炎症因子释放，而抗炎因子IL-10及Ⅱ型胶原蛋白表达明显增多[29]。这一结果与之前的动物实验结果相吻合。Wu等[30]从小鼠膝关节髌下脂肪垫中分离出AMSC来源外泌体，回输入关节后发现其能减少细胞凋亡，增加软骨基质合成，减缓骨关节炎进展；外泌体的这种保护作用主要源自其内高浓度的miR-100-5p。

5 结语

外泌体在关节腔内产生及释放的分子机制尚不十分清楚，目前研究证实不同组织来源的外泌体对膝骨关节炎产生及发展都起到了重要的作用，因此探索外泌体在膝骨关节炎病理发展过程中的作用机制将有助于筛选潜在的治疗靶点。同时间充质干细胞来源外泌体治疗膝骨关节炎也展现出光明的前景。相信未来以外泌体为基础的治疗手段将不断成熟完善，并使越来越多的膝骨关节炎患者受益。