干细胞在肌腱愈合中的应用

陶再进 李原歌 刘珅

随着体育运动的普及和发展，肌腱损伤逐步成为一种较常见的疾病。肌腱损伤的主要治疗方式为手术干预，以恢复受损肌腱的连续性。由于损伤的肌腱无法进行自我腱性修复，常形成瘢痕组织，造成功能受损，给患者及其家庭带来巨大压力[1]。近年来，应用干细胞治疗肌腱损伤已成为临床和科研的新热点，干细胞具有多向分化的潜能及自我更新的能力，其可分化产生多种特定组织类型的细胞。目前的研究常涉及肌腱干细胞(TDSC)、骨髓间充质干细胞(BMSC)和脂肪源性干细胞(ADSC)[2-3]。其中，BMSC和ADSC来源广泛，在特定条件下可分化为肌腱细胞[4]，常用于肌肉骨骼再生领域的研究[5]。TDSC对肌腱组织的发育、稳态维持、损伤修复及再生均有重要意义，且与肌腱细胞相似，可极大程度地重塑肌腱的生物力学功能，在运动型肌腱损伤的治疗中常作为首选[6]。因此，如何在肌腱损伤修复中扩增得到大量肌腱细胞或诱导干细胞定向分化为有组织功能的肌腱细胞已成为研究热点。

1 肌腱损伤愈合过程

肌腱为肌肉末端的结缔组织纤维索，由高度特化的平行胶原纤维组成。肌腱损伤后会通过一系列的级联反应进行修复，肌腱的修复过程分3个阶段，即炎症期、增殖期和重塑期。

在炎症期，首先伤处通过血管收缩和凝血级联反应开始止血，随后促炎细胞因子和趋化因子积聚，趋化因子的释放有利于损伤周围组织和肌腱鞘中肌腱细胞的迁移与激活，单核细胞可转化为巨噬细胞和中性粒细胞处理坏死碎片，Ⅲ型胶原蛋白开始合成；在增殖期，成纤维细胞迁移聚集在受损处合成胶原蛋白和蛋白聚糖等细胞外基质(ECM)成分。此阶段细胞增多，大量水分被吸收，胶原原纤维之间肌腱细胞的排列重新建立，Ⅲ型胶原蛋白合成达顶峰。重塑期在损伤6～8周后开始，其中包含2个亚阶段：第一个亚阶段细胞和基质产量减少，Ⅰ型胶原蛋白合成增加并开始替代Ⅲ型胶原蛋白；第二个亚阶段为成熟期，约在损伤10周后开始，胶原纤维交联增加并形成更成熟的纤维化组织，ECM合成增多，细胞密度和整体合成活性降低。其中，ECM重建是肌腱获得生物力学性能的关键过程[7]。

一般认为，肌腱愈合包括内源性愈合[8]和外源性愈合[9]2种途径。外源性愈合主要通过腱周组织粘连带入血运形成肉芽组织完成[10]；内源性愈合是在充分的滑液营养下，腱外膜、腱内膜共同参与肌腱细胞本身的增生，并通过合成和分泌胶原蛋白进行修复[11]。

2 干细胞治疗肌腱损伤愈合

2.1 BMSC

从骨髓中分离得到的间充质干细胞(MSC)是一类非造血干细胞的亚细胞群体，故被称为BMSC。MSC促进组织愈合的方式包括：①可分泌多谱系的细胞因子、趋化因子和生长因子，以阻断细胞凋亡，并促进相邻细胞增殖；②可通过细胞间的直接接触释放可溶性免疫抑制因子，以调控免疫应答；③可直接作用在损伤处并分化成多种细胞。同时MSC分泌的外泌体生物学功能广泛，可调节组织微环境，并促进组织修复和重建[12]。有研究表明，外泌体可抑制促炎细胞因子产生并减少瘢痕组织形成，从而促进愈合[13]。BMSC有如下特点：来源广泛，易于取材和分离纯化，能够克隆形成和进行自我增殖，并可多向分化成为肌腱、骨、软骨及脂肪等[14]。同时，BMSC几乎无免疫原性，且易于转染、表达外源基因[15]。实验研究表明，通过病毒载体向BMSC基因组转染外源目的基因有助于BMSC向肌腱组织细胞分化[16]。目前，BMSC被广泛应用于细胞治疗、基因治疗及组织工程领域。Liu等[17]对空白对照组、自体肌腱移植组以及应用BMSC组兔损伤跟腱的肌腱愈合情况进行比较，发现应用BMSC组肌腱愈合效果较其他2组更显著。BMSC可能受到体内微环境中某些因子的影响或调控，从而定向分化为肌腱组织。Hoffmann等[18]以MSC为种子细胞，通过肌腱组织工程方法修复大鼠跟腱损伤模型的受伤跟腱，发现组织微环境中的Smad8可促进BMSC腱性分化，并形成与正常肌腱细胞形态学结构和基因表达完全相同的肌腱细胞。

此外，细胞生长因子在肌腱损伤愈合的修复过程中也发挥重要作用。Li等[19]在肌腱-骨界面重建实验研究中将血小板源性生长因子转染至BMSC中，发现与原始的BMSC相比，转染血小板源性生长因子的BMSC能更有效地增强血管形成和胶原沉积。有研究表明，将转化生长因子(TGF)-β1基因转染至BMSC中更有利于细胞有效迁移至损伤处。与原始的BMSC治疗组相比，转染TGF-β1基因的BMSC治疗组损伤肌腱的愈合速度和ECM的重建速度更快，胶原蛋白合成增加更多，尤其是Ⅰ型胶原蛋白生成更快，且肌腱最大负荷能力和弹力更强，其中Ⅰ型胶原蛋白的主要功能是维持肌腱的机械性能[20]。Chai等[21]研究发现，BMSC经生长分化因子(GDF)-6培养后其腱性标志物scleraxis(SCX)和腱调蛋白(Tnmd)表达增加，可促进大鼠的损伤髌腱再生。一项研究表明，GDF-7/骨形态发生蛋白(BMP)-12可在体外上调马BMSC的核心蛋白聚糖(decorin)和Tnmd基因表达，证实其具有腱分化潜能[22]。有实验将经BMP-12处理的BMSC移植到大鼠缺损跟腱处，发现SCX、Tnmd、Ⅰ型胶原蛋白和腱糖蛋白(tenascin)-C等腱细胞谱系相关基因表达增加[23]。

综上所述，在肌腱损伤修复应用中，BMSC可作为肌腱组织工程研究中的种子细胞来源，是肌腱组织工程研究的重点。与直接应用生长因子相比，经过转染的干细胞可以稳定地分泌相关生长因子，是更具优势的促进肌腱愈合的替代方式。

2.2 ADSC

Zuk等[24]研究发现，一种从脂肪组织中获取的多能干细胞不但具有多向分化潜能，而且可表达与BMSC相似的标志物，于是将其定义为ADSC。ADSC是成体MSC中的一种，广泛分布于不同物种的脂肪组织中，并具有MSC这一类细胞的特异性表面标记[25]。与获取骨髓、胚胎、脐带等组织来源的干细胞不同，获取ADSC具有微创性、可重复性等优点，且ADSC易向多谱系分化。但与BMSC相比，其在肌腱损伤愈合应用中存在异位骨化[26]、基因突变等局限性。ADSC的应用优势体现在来源广泛、取材简单等方面，且脂肪基质血管能提供远高于骨髓所能提供的干细胞数量。此外，ADSC可表达更多的Ⅰ型胶原蛋白和Ⅲ型胶原蛋白，并可改变Ⅰ型胶原蛋白和Ⅲ型胶原蛋白的比值，从而促进ECM重塑。有研究分析了BMSC、ADSC及TDSC等的mRNA表达，发现ADSCⅠ型胶原蛋白α2链(Col1A2)和Ⅲ型胶原蛋白α1链(Col3A1) 表达最高，其Col1A2/Col3A1比值也明显高于其他组，而BMSC比值最低。上述研究均表明，在肌腱愈合过程中，ADSC在重塑ECM方面可能更具优势[27]。ADSC的应用方式包括直接作用和联合应用，不同的应用方式可影响ADSC促进肌腱愈合的作用。

2.2.1 直接移植于肌腱损伤部位

有研究将ADSC直接注射至大鼠肌腱损伤模型损伤部位，发现ADSC在损伤部位可存在至少4周，并可分泌tenascin-C和人特异性Ⅰ型胶原蛋白[28]。该研究认为，肌腱和韧带组织的相对特异性标志物是tenascin-C及SCX因子，其中tenascin-C能够抑制β1整合素依赖的细胞黏附并可调节细胞生长因子的活性[29]。Shen等[30]将ADSC直接用于犬损伤模型的滑膜内屈肌腱表面，发现ADSC可参与调控炎症反应，并可有效促进肌腱修复。上述研究均表明，ADSC在肌腱损伤愈合中可以分化为肌腱组织并分泌相关的特异性标志物。

2.2 复合富血小板血浆

Uysal等[31]利用ADSC联合富血小板血浆(PRP)对兔损伤跟腱进行实验，4周后发现ADSC联合PRP组肌腱的最大抗张力负荷增加较对照组更明显，其Ⅰ型胶原蛋白、成纤维细胞生长因子(FGF)和血管内皮生长因子(VEGF)表达均较对照组更高，但其TGF-β1、TGF-β2及TGF-β3表达则均较低。

2.3 联合水凝胶

已有研究证实，肌腱来源的水凝胶(tHG)可促进大鼠急性跟腱损伤模型愈合[7]。tHG促进肌腱愈合的作用机制包括：①可为受损肌腱提供ECM；②富含Ⅰ型胶原蛋白和Ⅲ型胶原蛋白，可以模拟天然肌腱[32]。tHG经ADSC及PRP优化后，肌腱愈合可得到进一步改善。研究显示，在tHG联合ADSC及成纤维细胞应用时，tHG可上调一些肌腱细胞标志物，从而创造出支持肌腱愈合的环境[33]。

3 TDSC

Bi等[34]首次从肌腱组织中获取了一种具有干细胞普遍特性的细胞群，该细胞群在体内可分化成肌腱组织，故可称为TDSC。TDSC修复损伤肌腱的作用机制包括：①可作为肌腱组织工程中的种子细胞，将TDSC 直接用于损伤肌腱处可诱导其腱性分化，并可促进Ⅰ型胶原蛋白和相关细胞因子分泌，从而恢复受损肌腱的功能；②在损伤肌腱处注入相应的细胞因子可激活肌腱组织中的TDSC并促进其增殖分化，从而达到修复受损肌腱的目的。Tian等[35]应用自体TDSC治疗大鼠损伤髌腱发现，实验组肌腱胶原蛋白表达升高，组织结构更加规则有序，且生物力学性能远优于对照组。Shen等[36]在兔肩袖损伤模型中将TDSC接种在针织丝-胶原海绵支架中，发现TDSC可诱导肌腱分化并分泌抗炎细胞因子，从而抑制免疫排斥反应，并促进肩袖的再生。

3.1 TDSC的优势

TDSC的优势可表现为其较高的成腱性。TDSC与肌腱细胞类似，在肌腱修复中有很强的特异性，可以更好地适应肌腱微环境而优先分化成腱细胞。Bi等[34]研究发现，与小鼠BMSC相比，小鼠TDSC可表达更多的SCX、软骨寡聚蛋白、SOX9和Runx2。有研究表明，在肌腱和韧带组织的相对特异性标志物中，SCX因子可介导肌肉在骨骼上附着，并可明显促进另一个腱性标志物Tnmd表达[37]。因此，人TDSC的Tnmd表达水平可比人BMSC更高。Tan等[38]研究发现，TDSC可表达更多的Oct4，其增殖能力和克隆形成能力均优于BMSC。有研究在比较TDSC与BMSC治疗小鼠损伤跟腱的效果时发现，TDSC组Ⅲ型胶原蛋白及其相关基因表达高于BMSC组，表明TDSC具有更高的再生潜能[2]。综上所述，TDSC较BMSC在肌腱损伤愈合方面更具优势。

3.2 影响TDSC成腱性分化的因素

TDSC具有MSC的多向分化特性，包括成腱性、成骨性、成软骨性及成脂性等[34]。其中，TDSC的成腱性在肌腱损伤愈合中有重要作用。TDSC作为种子细胞并联合肌腱组织工程技术和细胞因子可诱导其向肌腱细胞分化，从而促进肌腱的功能性愈合。Xu等[39]利用转染BMP-12和结缔组织生长因子的TDSC治疗大鼠损伤髌腱，发现经转染的TDSC成腱相关基因被激活，但其成骨、成软骨及成脂相关基因表达下降，同时实验组肌腱组织结构比对照组更规则、完整，且其最终破坏负荷更高。Lui等[40]用结缔组织生长因子和抗坏血酸对TDSC进行处理并将处理后的TDSC应用至大鼠肌腱缺损模型中，发现经处理的TDSC可通过smad1、smad5、smad8等信号转导通路促进肌腱相关蛋白表达，从而促进TDSC的成腱性分化，更利于肌腱功能性愈合。Zhang等[41]研究二甘聚糖对TDSC分化的影响，发现二甘聚糖调控TDSC成腱性分化的途径为通过刺激BMP-7来增加smad1、smad5、smad8的磷酸化，经低质量浓度的二甘聚糖处理后，TDSC可表达更多的SCX、血小板反应蛋白(THBS)-4及Tnmd等成腱性标志物。

BMP-2、高糖、高胆固醇等均可抑制肌腱干细胞的成腱性分化。Rui等[42]研究发现，BMP-2可抑制TDSC的成腱性分化，经BMP-2刺激后，Dcn、Bgn及Fmod等TDSC成腱性标志物表达减少。Shi等[43]在研究糖尿病小鼠的TDSC时发现，高糖环境可促进胶原糖基化，抑制ECM形成，下调Ⅰ型胶原蛋白和Tnmd等成腱性标志物。Li等[44]研究发现，胆固醇可下调TDSC成腱相关基因表达，Ⅰ型胶原蛋白、Ⅲ型胶原蛋白、Tnmd、SCX等肌腱标志物表达量与胆固醇浓度呈负相关。

4 结语

干细胞的应用研究与技术发展对肌腱损伤治疗具有十分重要的意义，因此受到广泛关注。细胞因子与干细胞的应用在肌腱损伤愈合中关系密切，但其具体作用机制还有待探索研究。BMSC、ADSC及TDSC均可分化为肌腱组织，但各自的分化途径不同，特点也不同。BMSC作为肌腱组织工程中的种子细胞可广泛应用于研究中，但其存在异位骨化的可能，且修复后肌腱的生物力学强度尚不能达到健康肌腱的标准。同时，如何在一定的时间窗使用一定浓度的基因转染方式确保BMSC更多地定向分化为肌腱组织还需进一步探索。ADSC获得相关并发症发病率低于BMSC，然而利用ADSC进行肌腱修复和再生的动物模型尚未得到充分研究，ADSC定向分化为肌腱组织及其相关因子的调控机制还有待进一步研究。支架材料的研究和应用是肌腱组织工程中的重要环节，以生物支架作为载体并用生长因子做诱导可促进ADSC腱性分化，将更好地发挥ADSC在肌腱损伤愈合中的作用。TDSC来源于肌腱组织，可以为肌腱愈合提供合适的微环境，但其调控因素很多，作用机制复杂，特性尚不明确，在很大程度上限制了其临床应用。同时，TDSC作为复杂的体内干细胞，在体外扩增后可能会发生表型漂移。在保持干细胞修复特性的前提下，开发大规模体外扩增干细胞的技术是一项重大挑战。