卵巢癌患者外周血miR-204表达变化的临床病理意义及其对Bcl-2、BDNF的调控作用

丁祺，杨红玉，常春，耿松珊，赵兴楠

卵巢癌是女性生殖系统三大恶性肿瘤之一，病死率居女性生殖系统恶性肿瘤首位[1]，因为卵巢癌早期缺乏典型的临床症状以及特异性的筛查方法，多数患者在诊断时已经发展至中晚期，虽然通过细胞减灭术及放化疗能够清除病灶、延长生存时间，但患者的整体预后情况并不理想。因此，寻找在卵巢癌诊断、预后评估中具有积极意义的生物标志物是该领域的研究热点，也具有迫切的临床需求。

微小RNA(microRNA，miRNA)是一种进化上高度保守的非编码小分子RNA，长度18～25个核苷酸，主要在转录后水平负向调控靶基因表达，进而在恶性肿瘤的发生发展过程中起促癌或抑癌作用。近些年，多种miRNAs被证实在卵巢癌患者外周血及病灶内存在异常表达[2]。miR-204是一种具有抑癌作用的miRNA，卵巢癌相关的细胞实验表明，B细胞淋巴瘤-2基因(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)、脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)是miR-204的靶基因，miR-204通过抑制Bcl-2、BDNF抑制卵巢癌细胞的增殖、侵袭[3-4]，但卵巢癌患者体内miR-204的变化情况尚不明确。本研究分析卵巢癌患者外周血miR-204表达变化的临床意义并在临床样本中验证miR-204靶向Bcl-2、BDNF的作用。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选择2016年1月至2018年2月在中国人民解放军联勤保障部队第九八〇医院诊断为卵巢癌的78例患者作为卵巢癌组，入组标准：① 经病理诊断为卵巢癌；② 临床病理资料完整；③ 随访资料完整。排除标准：① 术前接受过放化疗；② 既往有其他恶性肿瘤病史；③ 合并急慢性感染、血液系统疾病、自身免疫性疾病。另取同期60例健康体检女性作为对照组。本研究取得医院伦理委员会批准,研究对象知情同意。卵巢癌组年龄34～58岁、平均(42.73±7.92)岁，体质量指数(body mass index，BMI)(22.93±9.28) kg/m2；对照组年龄33～55岁、平均(41.84±8.29)岁，BMI(22.72±9.92)kg/m2。两组一般资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2 材料

血浆miRNA提取、反转录及PCR检测试剂盒均购自北京天根公司；RIPA裂解液、蛋白定量试剂盒(BCA法)购自上海碧云天公司，兔来源Bcl-2、BDNF一抗购自Abcam公司；卵巢癌细胞株SKOV3购自中科院上海细胞资源中心；miR-204模拟物及阴性对照(NC)模拟物购自上海吉玛公司，Bcl-2、PTEN的双荧光素酶报告基因及检测系统购自Promega公司。

1.3 方法

1.3.1 外周血miR-204表达的检测 卵巢癌组患者术前抽取外周静脉血3 mL，对照组志愿者体检时抽取外周静脉血3 mL，按照试剂盒进行实验操作，提取miRNA后反转录合成为相应的cDNA，配置荧光定量PCR反应体系，分别使用目的基因miR-204及内参基因U6，在荧光定量PCR仪中进行扩增反应，得到反应的循环曲线及循环阈值(Ct)，代入公式2-ΔΔCt计算miR-204的表达量。

1.3.2 卵巢癌中Bcl-2、BDNF表达的检测 取卵巢癌组织，加入RIPA裂解液并充分匀浆，匀浆液4℃、12 000转/min离心10 min，分离上清液并采用BCA法检测蛋白含量，根据检测结果、每个样本取30 μg蛋白在SDS-聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳，而后电转移至PVDF膜，封闭、孵育一抗(Bcl-2、BDNF一抗1∶1 000稀释，β-actin一抗1∶5 000稀释)、孵育二抗，加入ECL显影液、在凝胶成像系统中进行成像，得到Bcl-2、BDNF、β-actin的条带及灰度值，以β-actin为内参计算Bcl-2、BDNF的表达水平。

1.3.3 预后随访 采用电话回访、门诊复查等方式进行随访，随访起始时间为术后第1天，截止时间为2019年10月31日。无进展生存率(progression-free survival，PFS)为术后第1天起，至发生复发、转移及其他原因引起死亡的时间；总生存率(overall survival，OS)为术后第1天起，至死亡的时间。

1.3.4 miR-204生物信息学分析 在targetscan网站http:∥www.targetscan.org/vert_72/中输入“miR-204”后得到靶基因列表，根据列表中Bcl-2、BDNF的信息得到miR-204靶向Bcl-2、BDNF基因mRNA 3′UTR的生物信息学预测结果。

1.3.5 细胞实验 SKOV3细胞在含有10%胎牛血清的培养基中贴壁培养，常规消化传代后接种在24孔培养板内，而后进行分组：miR-NC组共转染NC模拟物及双荧光素酶报告基因，miR-204组转染miR-204模拟物及双荧光素酶报告基因，转染24h后采用双荧光素酶报告基因检测系统检测萤火虫荧光值及海肾荧光值，计算萤火虫荧光值/海肾荧光值作为报告基因的荧光活力。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 两组外周血miR-204表达水平比较

与对照组比较(1.00±0.27)，卵巢癌组患者外周血miR-204的表达水平(0.58±0.19)明显降低，差异有统计学意义(t=5.191，P<0.001)。

2.2 卵巢癌组中不同临床病理特征患者外周血miR-204表达水平比较

卵巢癌组中不同年龄、病理分级、组织类型患者外周血miR-204表达水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)，FIGO分期III～IV期患者外周血miR-204表达水平明显低于I～II期患者，发生淋巴结转移患者外周血miR-204表达水平明显低于未发生淋巴结转移患者，CA125>200 U/mL患者外周血miR-204表达水平明显低于CA125≤200 U/mL患者，差异均有统计学意义(P<0.05),详见表1。

表1 卵巢癌组中不同临床病理特征患者外周血miR-204表达水平比较

2.3 卵巢癌组中不同miR-204表达水平患者无进展生存率和总生存率比较

将卵巢癌组患者分为外周血miR-204表达水平≥中位数的高表达患者、miR-204表达水平<中位数的低表达患者，绘制PFS和OS的Kaplan-Meier曲线，与miR-204低表达患者比较，miR-204高表达患者的PFS及OS均明显提高，差异有统计学意义(P<0.05),见图1、图2。

2.4 miR-204靶向Bcl-2、BDNF的临床样本验证

经western blot检测卵巢癌组织中Bcl-2、BDNF的表达水平，与miR-204低表达患者比较，miR-204高表达患者卵巢癌组织中Bcl-2、BDNF的表达水平明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)，见下页表2，图3；经Targetscan网站分析miR-204的靶基因，Bcl-2及BDNF基因mRNA 3′UTR中含有miR-204的结合靶点，见下页图4。

图1 miR-204低表达与高表达患者PFS的Kaplan-Meier曲线

图2 miR-204低表达与高表达患者OS的Kaplan-Meier曲线

图3 卵巢癌组中不同miR-204表达水平患者 Bcl-2、BDNF的蛋白条带

表2 卵巢癌组中不同miR-204表达水平患者Bcl-2、BDNF表达水平比较

图4 miR-204靶向Bcl-2及BDNF基因 mRNA 3′UTR的生物信息学预测

2.5 miR-204靶向Bcl-2、BDNF的双荧光素酶报告基因验证

在SKOV3细胞中，miR-204组野生型Bcl-2报告基因的荧光活力、野生型BDNF报告基因的荧光活力均低于miR-NC组(P<0.05)；根据生物信息学预测对双荧光素酶报告基因进行突变，miR-204组突变型Bcl-2报告基因的荧光活力、突变型BDNF报告基因的荧光活力与miR-NC组比较差异均无统计学意义(P>0.05)，见图5、图6。

注：与miR-NC组比较，*P<0.05图5 miR-NC组与miR-204组Bcl-2报告基因荧光活力的比较

注：与miR-NC组比较，*P<0.05图6 miR-NC组与miR-204组BDNF报告基因荧光活力的比较

3 讨论

卵巢癌的发病涉及多基因、多步骤，但具体的分子机制并不明确，临床上不仅缺乏诊断卵巢癌及评价卵巢癌病情、预后的分子标志物，也缺乏有效的靶向治疗手段。近些年，miRNA在卵巢癌发病中的作用受到越来越多关注，多种miRNA被证实在卵巢癌组织中异常表达并起到促癌或抑癌作用[5-6]，同时也有研究关注了外周血miRNA在卵巢癌诊断及病情评估中的价值[7]。miR-204是一种具有抑癌作用的miRNA，根据Yuan D等[8]、Liang CY等[9]、Zhuang Z等[10]的研究结果，miR-204在卵巢癌、肺癌、头颈部恶性肿瘤中的表达均显著下调。除了在肿瘤组织中可检测到miR-204外，在外周血中也可检测到miR-204的表达，Li X等[11]和Estephan LE等[12]的研究报道了外周血miR-204对肺动脉高压的诊断及评估价值。本研究发现：卵巢癌患者外周血中miR-204的表达水平低于对照组，与其在卵巢癌中表达降低的趋势一致，提示卵巢癌患者外周血miR-204的低表达可能可以用于病情及预后的评估。

miR-204的抑癌作用已经被多项细胞实验证实，Guo J 等[13]的研究证实，miR-204能够抑制膀胱癌细胞的增殖；Zhang J等[14]的研究证实，miR-204对胃癌细胞的淋巴结转移具有抑制作用；Tang J等[15]的研究证实，miR-204对食管癌细胞的增殖和侵袭具有抑制作用。在卵巢癌的发生发展过程中，癌细胞过度的增殖和侵袭与病情发展、病理特征恶化密切相关，miR-204表达降低可能削弱其抑制增殖、侵袭的作用，进而参与病情发展及病理特征变化。本研究通过分析不同临床病理特征卵巢癌患者外周血miR-204表达的差异可知：miR-204的表达水平与FIGO分期、淋巴结转移、CA125水平有关，随着FIGO分期的增加、淋巴结转移的发生、CA125水平的升高，外周血miR-204的表达水平明显降低，表明卵巢癌患者外周血miR-204表达水平的降低与多项临床病理特征的恶化有关，提示miR-204低表达参与了卵巢癌病情的发展、与其在体外实验中介导的抑癌作用吻合。

国内多项关于卵巢癌预后因素的临床研究认为，FIGO分期、淋巴结转移、CA125水平是生存预后的影响因素[16-18]；本研究已经证实，miR-204低表达与三项预后影响因素FIGO分期、淋巴结转移、CA125水平均存在相关关系。基于此，本研究对卵巢癌患者的PFS和OS进行了随访，绘制Kaplan-Meier曲线后通过Log-rank检验分析不同miR-204表达水平的患者PFS和OS的差异可知：miR-204高表达患者的PFS及OS均明显提高。这一结果表明，卵巢癌患者外周血miR-204低表达与远期生存情况的恶化有关，与其促进临床病理特征恶化的结果及临床病理特征恶化是预后影响因素的结果一致。

miRNA通过结合靶基因mRNA 3′UTR在转录后水平实现对靶基因表达的负调控。卵巢癌中miR-204调控细胞增殖、侵袭的研究显示，miR-204能够抑制Bcl-2和BDNF的表达。Bcl-2和BDNF是两种在卵巢癌中高表达的基因[19-20]，相关的细胞实验也证实Bcl-2和BDNF能够促进卵巢癌细胞的增殖、侵袭，抑制卵巢癌细胞的凋亡[21-22]。国内闫洪亮等[3]和范晓红等[4]的细胞实验证实，miR-204能够抑制卵巢癌细胞中BDNF、Bcl-2的表达，进而抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡。本研究在上述细胞实验的基础上，通过生物信息学分析及临床样本检测的方式验证了miR-204对BDNF和Bcl-2的靶向作用。在Targetscan中进行生物信息学预测发现：miR-204分别靶向BDNF基因mRNA 3′UTR的第178-184碱基、Bcl-2基因基因mRNA 3′UTR的第209-216碱基；检测BDNF和Bcl-2的表达发现：miR-204高表达患者卵巢癌组织中Bcl-2、BDNF的表达水平均低于miR-204低表达患者。以上结果表明，miR-204能够靶向Bcl-2、BDNF，当miR-204表达增加时，Bcl-2、BDNF的表达相应减少。此外，本研究还通过细胞实验进行了miR-204靶向Bcl-2、BDNF的验证，转染miR-204模拟物后，细胞中野生型Bcl-2、BDNF报告基因的荧光活力降低，而根据Targetscan中进行生物信息学预测结果进行报告基因的突变后、miR-204不再影响报告基因的荧光活力，以上结果表明miR-204靶向Bcl-2及BDNF基因mRNA 3′UTR且靶向位点与生物信息学预测一致。

综上所述，卵巢癌患者外周血中miR-204的表达明显降低，低表达的miR-204与病理特征及生存情况恶化有关，同时也与Bcl-2及BDNF表达增多有关，靶向Bcl-2及BDNF可能是miR-204参与卵巢癌发病及病情发展的分子机制。