内质网应激在卵巢衰老中的研究进展

伏玉洁，张学红

卵巢是女性对老化最为敏感的器官，伴随个体年龄增长的卵巢功能衰退为生理性卵巢衰老，年龄是预测生育力的粗标准，是预测自然受孕或体外受精-胚胎移植成功概率的基本指标[1]。而由于遗传和环境等因素作用导致的卵巢功能提前衰退即非生理性卵巢衰老，其发生与年龄无直接关系。内质网是负责几种特定细胞功能的主要细胞器，这些功能包括细胞表面蛋白的合成、折叠、修饰、运输和分泌，脂质代谢和Ca2+存储。在蛋白质的生产过程中，几个内质网特异性分子可感应合成蛋白质的数量和质量，以及是否正确折叠成其天然结构。在此过程中，未折叠或错误折叠的蛋白质在内质网内腔中的过多积累会导致内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)。为了应对增加的折叠需求，细胞激活了未折叠蛋白反应(unfolded protein reaction，UPR)，UPR能够在转录翻译水平上维持内质网稳态，减少未折叠蛋白及错误折叠蛋白的合成[2]。UPR最初是一种细胞的保护性反应，是细胞针对有害刺激而产生的自身代偿性行为。过度UPR影响细胞内质网稳态，持续的功能紊乱会诱发细胞死亡，从而导致各种疾病的发生。慢性ERS是诸多疾病的主要病因，包括神经退行性疾病、糖尿病、癌症和代谢性疾病[3]。ERS是与炎症和氧化应激密切相关的局部因素，也是组织纤维化中促纤维化重构的重要决定因素[4]。越来越多的证据表明，UPR与卵巢发育和功能的发挥之间存在联系，包括卵泡生长和成熟，卵泡闭锁和黄体生成。另外，在病理条件下，ERS和UPR在卵巢中也可能起重要作用[5]。本文主要对ERS在卵巢生理和病理中的双重作用进行综述，为诊断和治疗卵巢衰老潜在作用靶点提供新的思路。

1 内质网应激

UPR信号是由3个ERS调节蛋白所介导的，分别是肌醇需求激酶1(inositol requiring protein 1，IRE1)、蛋白激酶R样内质网激酶(PKR-like ER kinase,PERK)、激活转录因子-6(activating transcription factor 6，ATF6)[6]。如PERK被激活后通过磷酸化真核转录起始因子2α(eukaryotic translation initiation factor 2α，eIF2α)，从而抑制核糖体组装来整体抑制蛋白合成，同时还上调激活转录因子-4(activating transcription factor 4，ATF4)，来诱导细胞稳态基因的表达，并激活转录因子CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CCAAT/enhancer-binding protein homologous protein，CHOP)等促凋亡因子。另外，ATF4亦可以诱导激活转录因子-3(activating transcription factor 3，ATF3)的表达，继而通过结合组蛋白脱乙酰化酶抑制基因转录。正常状况下，内质网标志性伴侣蛋白葡萄糖调节蛋白78 kDa(glucose-regulated protein 78 kDa，GRP78)又称重链免疫球结合蛋白(immunoglobulin heavy chain binding protein，BIP)，主要和IRE1、PERK、ATF6稳定结合，呈现封闭UPR的无活性状态，GRP78参与了内质网的大部分功能，其中重要的一点是，帮助蛋白质新生肽链折叠[7-8]。当内质网中错误折叠或未折叠蛋白量超过了积累的阈值，GRP78就会与内质网跨膜传感器分离，并激活所有传感器介导的信号通路。但超负荷的ERS会启动细胞凋亡途径，ERS继发细胞凋亡主要有3条通路：C-Jun氨苯末端激酶(c-Jun N-terminal kinases，JNK)通路、半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶12(cysteine aspartic acid specific protease 12，Caspase12)凋亡通路和CHOP相关通路[6]。

2 内质网应激与颗粒细胞

卵巢颗粒细胞是指包绕在卵母细胞外围的细胞层，是卵母细胞基本的供能细胞。作为卵巢组织内最重要的体细胞，卵巢颗粒细胞和卵泡液构成了卵母细胞最主要的微环境，其与卵母细胞之间存在着广泛、紧密、复杂的多重联系[9]。颗粒细胞的凋亡对于优势卵泡的选择非常关键，影响着正常卵巢功能的发挥[10]。如Luman募集因子(Luman recruiting factor，LRF)可能通过ERS途径参与诱导颗粒细胞凋亡，并且可能在小鼠卵泡选择中起关键作用[11]。ERS途径参与诱导的颗粒细胞凋亡与卵泡闭锁密切相关，凋亡诱导因子(apoptosis inducing factor，AIF)主要位于颗粒细胞中，在卵泡闭锁过程中，AIF的表达显著增加。AIF介导Caspase依赖性细胞凋亡并引起染色质固缩和DNA片段化，而AIF耗竭或AIF基因的敲除可以保护ERS介导的山羊颗粒细胞凋亡。AIF可能是卵泡闭锁过程中的关键因素[9]。Sigma-1受体在卵巢组织广泛表达，参与卵巢功能的调节。Sigma-1受体蛋白与GRP78紧密结合，发挥促进蛋白正确折叠、调节细胞增殖活性、维持内质网稳态等多重保护效应[12]。卵巢储备功能低下患者颗粒细胞中Sigma-1受体表达量下降伴随着细胞凋亡率的上升。在卵巢颗粒细胞体外培养体系中，通过激活Sigma-1受体，调控ERS诱导的细胞凋亡通路，可改善细胞凋亡状态，这可为卵巢储备功能下降疾病的病因探讨及患者临床治疗提供新的思路[1]。

ERS是与炎症密切相关的局部因素[4]。脂多糖处理可诱导小鼠颗粒细胞内ERS和血清雌激素水平降低。通过抑制炎症反应可减少ERS的激活并减少血清雌激素水平的降低[13]。子宫内膜异位症患者颗粒细胞中的衰老表型和ERS加剧[14]。褪黑激素给药可在体内外改善子宫内膜异位症患者卵巢颗粒细胞的中细胞衰老表型以及线粒体膜电位和三磷酸腺苷的异常，并在体外通过抑制ERS标记GRP78和CHOP,从而改善小鼠卵巢颗粒细胞生存能力[15]。ERS也是与氧化应激密切相关的局部因素[4]。跨膜结构和卷曲螺旋结构域1蛋白(transmembrane and coiled-coil domain，TMCO1)是一种内质网跨膜蛋白，可主动防止Ca2+储备过多。TMCO1基因敲除小鼠(TMCO1 -/-)表现出卵巢卵泡逐渐丧失，卵巢卵泡发育受损和亚生育力，其表型类似于女性的卵巢早衰。TMCO1 -/-小鼠颗粒细胞中ERS介导的细胞凋亡增加和活性氧水平升高，表明TMCO1缺乏引起颗粒细胞功能障碍，从而导致卵巢卵泡发育受损[16]。

在生殖毒理学研究中发现，一种来自镰刀菌真菌的非甾体类雌激素霉菌毒素，玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZEA)以剂量依赖性方式降低卵巢颗粒细胞的细胞活力并增加细胞凋亡，ZEA通过上调与ERS相关的蛋白GRP78，HERP和CHOP来激活ERS。而内质网膜蛋白HERP的耗竭通过自噬激活和凋亡抑制作用从而阻止ZEA诱导的卵巢颗粒细胞凋亡[17]。毒胡萝卜素(thapsigargin，Tg)在体外通过诱导山羊颗粒细胞系中的ERS，从而降低了孕酮的产生和类固醇生成酶的表达[18]。临床研究发现不育症患者的卵泡液中存在较高水平的棕榈酸，且具有颗粒细胞毒性，棕榈酸影响了细胞增殖，凋亡和ERS标志物，如降低了颗粒细胞中磷酸化蛋白激酶B(一种抗凋亡相关蛋白)水平并增加了caspase-3和CHOP的表达水平[19]。

人胎盘来源的间充质干细胞(human placenta-derived mesenchymal stem cells，hPMSCs)的移植通过抑制ERS的IRE1α信号通路诱导的颗粒细胞凋亡，从而改善自身免疫性卵巢早衰小鼠的卵巢衰竭，有助于卵巢功能恢复[20]。顺铂诱导的ERS可能促进颗粒细胞的自噬和凋亡，从而引起过多的卵泡丢失和内分泌失调。用4-苯基丁酸减轻ERS，可以防止顺铂诱导的颗粒细胞凋亡和卵巢损伤。因此，在女性化疗期间，4-苯基丁酸可用于保护卵巢。研究结果可作为确定由化疗引起的卵巢损伤的潜在病理生理学的参考点，并可能提供潜在的药物治疗选择[21]。

3 内质网应激与卵泡生长、成熟、闭锁

内质网稳态在卵巢卵泡形成，卵丘细胞存活，卵丘-卵母细胞复合体相互作用以及卵母细胞质量中起着至关重要的作用[22]。UPR在卵泡生长过程中被激活，参与卵泡生长和成熟、卵泡闭锁和胚胎植入等过程[18,23]。在32周龄小鼠的生发泡(GV)阶段卵母细胞中，ERS相关基因(包括AdipoR2，IRAK-1，RCAN1和MsrB1)显著下调，表明ERS可能在卵母细胞衰老中发挥作用[24]。牛磺熊去氧胆酸(tauroursodeoxycholic acid，TUDCA)通过减轻潜在的错误折叠蛋白质的聚集，以减轻ERS，作为化学伴侣参与导致细胞适应和存活的各种信号传导途径[25]。ERS的存在会损害牛卵母细胞复合物成熟过程中的发育能力，而这一过程可以被TUDCA逆转[26]。卵母细胞体外成熟培养(in vitro maturation，IVM)系统证明TUDCA补充至培养基，可通过减轻ERS改善小鼠未成熟卵母细胞IVM后的胚胎发育[27]。在原代培养4～5代的衰老的小鼠卵巢表面上皮细胞中发生的UPR，这种细胞衰老可通过TUDCA缓解[28]。

糖化是细胞衰老的主要原因。人的半乳糖1磷酸尿嘧啶转移酶(galactose-1 phosphate uridylyltransferase，GalT)活性降低会导致经典半乳糖血症，而GalT缺乏症(GalT -/-)小鼠与患者具有相似的临床特征，如表现为亚生育力和小脑共济失调。GalT -/-小鼠卵巢组织显示ERS标记物，GRP78升高，并且经典的抗凋亡、促存活的通路磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信号下调。突变体中原始卵泡的数量减少，从而重现了人类患者中卵巢加速老化的现象[29]。口服化合物Salubrinal(eIF2α磷酸酶抑制剂)可导致卵巢GRP78表达降低，挽救PI3K/Akt信号传导，并使GalT -/-小鼠卵巢组织中的原始卵泡数量增加一倍。Salubrinal以通过ERS调节蛋白PERK介导的相关作用来防止半乳糖血症引起的原始卵泡丢失，并且这种方式的干预显著改善卵巢功能，提高生育能力和生殖力[29]。卵泡中晚期糖基化终产物(advanced glycation end products，AGEs)影响滤泡微环境，在含有卵母细胞的卵泡中，卵泡液中游离AGEs的含量增加，可导致卵母细胞发育为形态不良的胚胎，并且AGEs通过激活UPR因子ATF4刺激了颗粒细胞中IL-6和IL-8的产生。卵泡中AGEs的积累通过激活卵泡微环境中的ERS而触发炎症，从而降低了卵母细胞的能力。ERS可能是潜在的治疗靶点，可改善表现出AGEs卵巢积聚患者的卵母细胞发育能力[30]。

生殖毒理学研究发现，棕榈酸影响猪卵母细胞中组蛋白修饰和表观遗传标记，细胞凋亡和ERS标志物，从而损害体外生长的卵母细胞的发育能力[19]。在小鼠卵丘-卵母细胞复合物中，脂肪酸诱导的ERS会损害蛋白质分泌和线粒体活性，从而导致异常的胚胎发育，这种异常可被ERS抑制剂逆转[31]。壳聚糖纳米颗粒(chitosan nanoparticle,CSNP)用作药物或基因传递载体。CSNPs可以被内化到小鼠胚泡中，例如透明带、玻璃体周间隙和细胞质。CSNPs诱导的ERS会同时增加GRP78，CHOP，ATF4，PERK和IRE1 mRNA的表达水平以及活性氧。此外，CSNPs显示出双膜和多膜自噬囊泡，并导致囊胚细胞死亡。相反，雷帕霉素(作为治疗细胞增殖和应激反应的重要调节剂)的治疗减少了CSNPs诱导的线粒体Ca2+超载、细胞凋亡、氧化应激、ERS和自噬。雷帕霉素治疗可以改善CSNPs诱导的植入前胚胎发育缺陷。这项研究的数据将有助于了解这些CSNP的毒性，并使更安全的纳米材料得以生物工程化[32]。

ERS是与氧化应激密切相关的局部因素。褪黑激素可通过降低氧化应激诱导的ERS来保护其免受表柔比星诱导的卵巢损害。化疗增加肿瘤患者存活并降低复发，但它会诱发卵巢损伤，并导致化疗引起的闭经，探索机制并确定针对化疗期间卵巢毒性的保护剂是当务之急[33-34]。在经衣霉素(5μg/ mL，22小时)预处理的猪成熟卵丘-卵母细胞复合物中添加褪黑激素(0.1μmol/ L)可恢复减数分裂成熟率和大多数UPR标记物(GRP78，ATF4，ATF6和CHOP)的表达。体现了褪黑激素在猪卵母细胞体外培养过程中对UPR信号通路的调节和减少ERS中的作用[35]。

静脉内将人类内皮祖细胞(human endothelial progenitor cells,hEPCs) 给药到老年小鼠中，通过迁移，归巢到目标组织、整合新血管形成促进血管修复，可减少炎症、ERS和凋亡，从而增强胚胎发育和卵母细胞质量。hEPCs处理的老年小鼠的卵裂和胚泡形成率以及囊胚中细胞数量的增加证明了hEPCs对生殖衰老具有保护作用。hEPCs虽不能挽救因衰老而丢失的卵母细胞，但可以显著延迟与年龄有关的生育能力下降[36]。

4 结语与展望

ERS在卵巢颗粒细胞和卵泡液构成的卵母细胞微环境稳态的维持、卵泡发育的不同阶段中起到了重要的作用，ERS与炎症、氧化应激等局部因素协调作用，对颗粒细胞的凋亡、卵母细胞发育和雌孕激素的分泌调控有着重要的影响。随着不同因素导致卵母细胞数量减少和质量的下降，激活ERS，加速了疾病的进程。反之，ERS也会通过若干机制来保护卵巢功能，具体机制还需进一步深入的分子生物学研究。尽管卵巢早衰的发病率逐年提高，但是导致该病进展的潜在机制还未被完全阐明，而ERS发生通路中的关键蛋白有望成为治疗卵巢早衰的潜在作用靶点。随着再生医学的发展，干细胞给药有望成为治疗不育或化学疗法等因素诱发的卵巢损伤的新策略。抗ERS或凋亡疗法可能是延缓与年龄相关的不育症的关键方法，从而为揭示某些生殖内分泌疾病的发病机理，探索新型治疗方法，改善辅助生殖技术提供新的指导。