罗哌卡因调控PI3K/Akt信号通路影响宫颈癌细胞HeLa的生物学行为

陈丽娟，张宏，张健，邓大立，吴瑕

宫颈癌是全球女性癌症死亡的主要原因之一。据统计，全球每年约有新增宫颈癌患者50万例，并有30万人死于宫颈癌[1]。早期宫颈癌可通过手术切除治愈，但宫颈癌患者多为晚期或发生转移，且放化疗未能取得理想效果，患者预后较差[2-4]。因此，寻找新的宫颈癌治疗策略至关重要。罗哌卡因是一类长效局麻药，可用于减少急性、慢性和癌症疼痛[5]。罗哌卡因和舒芬太尼的联用可有效减轻宫颈癌根治术术后疼痛，是妇科手术理想的镇痛方法[6]。最近研究发现，罗哌卡因可抑制乳腺癌、结肠癌细胞增殖以及结肠癌皮下瘤的生长，具有抗肿瘤作用[7-8]。但罗哌卡因对宫颈癌生物学行为的影响尚不清楚。本研究探讨了罗哌卡因对宫颈癌HeLa细胞增殖、迁移侵袭和凋亡的影响，初步分析其潜在分子机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料

HeLa细胞购于上海通派生物科技有限公司；青链霉素双抗溶液购于北京索莱宝生物科技有限公司；DMEM培养基和胎牛血清购于美国Hyclone公司；CCK-8试剂盒购于上海贝博生物科技有限公司；罗哌卡因(CAS号：98717-15-8，纯度98%)购于上海研生实业有限公司；Transwell小室和基质胶购于美国Corning公司；Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒购于美国Sigma公司；RIPA裂解液、聚偏二氟乙烯(PVDF)膜、二喹啉甲酸(BCA)试剂盒购于上海碧云天公司；山羊抗兔IgG、细胞周期依赖性激酶4(Cycle-dependent kinase 4，CDK4)兔单克隆抗体、MMP-2兔多克隆抗体、Bcl2兔单克隆抗体、Bax兔单克隆抗体购于美国Abcam公司；Akt兔多克隆抗体以及β-actin、p-Akt兔单克隆抗体购于美国CST公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 HeLa细胞接中含DMEM培养基(添加10%的胎牛血清和1%的青链霉素双抗溶液)培养瓶在37℃，CO2体积分数5%的恒温培养箱培养，每两天更换一次培养液，当细胞融合度约为80%时，用胰酶消化传代。

1.2.2 CCK-8法检测细胞增殖活力 按照每孔5×103个细胞数(100 μL)的密度将对数生长期HeLa接种于96孔板，贴壁后，弃去细胞培养基，用含不同浓度(0、100、200和400 μg/mL)罗哌卡因的DMEM培养液(100 μL/孔)培养HeLa细胞48 h，参考CCK-8试剂盒加入CCK-8试剂。全自动酶标仪检测各孔细胞在450 nm波长处的吸光度(A)值。

1.2.3 Transwell法检测细胞迁移和侵袭 侵袭实验：用DMEM培养基按照1∶8比例稀释Matrigel，取50 μL均匀铺于于Transwell小室膜表面，4℃风干。收集罗哌卡因(400 μg/mL)处理48 h的HeLa细胞和正常培养的HeLa细胞，胰酶消化细胞后，磷酸盐缓冲液洗涤细胞2次，用无血清DMEM培养基重悬使细胞浓度为2×105个/mL。向Transwell上室加入200 μL细胞悬液，取500 μL含DMEM培养基(10%胎牛血清)加入向24孔板下室，常规培养24 h，用棉签擦去基质胶和上室内的细胞，用0.1%结晶紫染色20 min，随后将Transwell小室倒置于显微镜下随机选取5个视野进行观察、拍照、计数，以5个视野细胞数平均值表示侵袭细胞数目。迁移实验用未包被基质胶的小室，其他步骤参考侵袭实验。

1.2.4 流式细胞术检测细胞凋亡 胰酶消化罗哌卡因(400 μg/mL)处理48 h的HeLa细胞和正常培养的HeLa细胞，磷酸盐缓冲液冲洗细胞2次，用1×结合缓冲液调整为细胞浓度为1×106个/mL。参照Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒使用说明分别加入Annexin V-FITC和PI，室温避光反应15 min，1 h内上机检测细胞凋亡情况。

1.2.5 Western bot检测CDK4、MMP-2、Bcl2、Bax以及磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)通路相关蛋白的表达水平 收集罗哌卡因(400 μg/mL)处理48 h的HeLa细胞和正常培养的HeLa细胞，RIPA缓冲液裂解细胞，15 000 rpm离心10 min获得的上清液即为细胞总蛋白。将适量细胞蛋白与等体积的1×上样缓冲液混合，100℃沸水浴3 min变性细胞蛋白。按照每孔30 μg加样进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，蛋白分离后利用半干转膜仪进行转膜。将膜置于孵育盒内，4℃下用5%脱脂牛奶封闭膜过夜。TBST洗膜后，室温下分别加入CDK4(1∶2 000)、MMP-2(1∶500)、Bcl2(1∶1 000)、Bax(1∶1 000)、p-Akt(2∶1 000)、Akt(1∶1 000)和β-actin(1∶1 000)抗体孵育膜2 h，TBST洗膜10 min×3次。用Ⅱ抗孵育1 h后，TBST洗膜10 min×3次。化学发光法显影后，以β-actin为内参，Graphpad软件分析目的条带的灰度值。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 罗哌卡因对宫颈癌HeLa细胞和正常宫颈细胞Ect1/E6E7增殖的影响

采用不同浓度罗哌卡因处理HeLa细胞和Ect1/E6E7细胞48 h，CCK-8法检测细胞增殖活力，结果显示，与0 μg/mL组比较，100 μg/mL、200 μg/mL、400 μg/mL组HeLa细胞的增殖活力显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)，随着罗哌卡因浓度增加，其对HeLa细胞的增殖抑制作用逐渐增加；与0 μg/mL组比较，400 μg/mL组Ect1/E6E7细胞的增殖活力显著降低，差异均有统计学意义(P<0.05)，100 μg/mL、200 μg/mL组Ect1/E6E7细胞的增殖活力没有明显变化,差异无统计学意义(P>0.05)，详见表1，表明罗哌卡因对HeLa细胞有抑制作用且在较低浓度时对Ect1/E6E7细胞没有明显的细胞毒作用，选择较低浓度的200 μg/mL进行后续实验。

表1 不同浓度罗哌卡因对HeLa细胞增殖的影响

2.2 罗哌卡因对HeLa细胞迁移和侵袭的影响

采用200 μg/mL罗哌卡因处理HeLa细胞48 h，Transwell法检测HeLa细胞迁移和侵袭能力，结果显示，与对照组比较，罗哌卡因处理组HeLa细胞的迁移和侵袭数目显著减少，差异有统计学意义(P<0.05)，见图1和表2。提示罗哌卡因可抑制HeLa细胞迁移和侵袭。

图1 罗哌卡因对HeLa细胞迁移和侵袭的影响

表2 罗哌卡因对HeLa细胞迁移和侵袭的影响

2.3 罗哌卡因对HeLa细胞凋亡的影响

采用200 μg/mL罗哌卡因处理HeLa细胞48 h，流式细胞术检测细胞凋亡，结果显示，与对照组比较，罗哌卡因处理组HeLa细胞凋亡率显著增加，差异有统计学意义(P<0.05)，详见表3和图2。提示罗哌卡因可促进HeLa细胞凋亡。

图2 罗哌卡因对HeLa细胞凋亡的影响

表3 罗哌卡因对HeLa细胞凋亡的影响

2.4 罗哌卡因对HeLa细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡相关蛋白表达的影响

采用200 μg/mL罗哌卡因处理HeLa细胞48 h，Western blot检测CDK4、Bcl-2、MMP-2和Bax蛋白表达水平，结果显示，罗哌卡因处理组HeLa细胞CDK4、MMP-2、Bcl-2蛋白的表达水平与对照组比较显著降低，而Bax蛋白的表达水平与对照组比较显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)，见图3。

图3 罗哌卡因对HeLa细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭相关蛋白表达的影响

2.5 罗哌卡因对HeLa细胞PI3K/Akt信号通路相关蛋白表达的影响

采用200 μg/mL罗哌卡因处理HeLa细胞48 h，Western blot分析PI3K、Akt、p-PI3K和p-Akt蛋白表达水平，结果显示，与对照组比较，罗哌卡因处理组HeLa细胞总PI3K和Akt蛋白的表达水平变化无统计学意义，p-PI3K和p-Akt的表达水平显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)，见图4。提示罗哌卡因可抑制HeLa细胞PI3K/Akt信号通路活化。

图4 Western blot检测罗哌卡因对HeLa细胞 PI3K/Akt信号通路相关蛋白表达的影响

3 讨论

罗哌卡因是单一对映结构体长效酰胺类局麻药，已广泛用于介入性手术。最近研究发现，在进行肿瘤切除术时使用局部麻醉可以减少癌症复发，提高生存率[5]。一定浓度的局部麻醉药可抑制肿瘤细胞增殖、侵袭和迁移，促进细胞凋亡[9]。本研究拟探讨罗哌卡因对宫颈癌HeLa细胞增殖、迁移侵袭和凋亡的影响和其潜在的分子机制。

近年来，罗哌卡因在癌症研究中的作用受到越来越多的关注。Wang等[10]研究发现罗哌卡因可抑制肝癌细胞活力，并通过破坏线粒体功能激活caspase-3信号通路促进肝癌细胞凋亡；Yang等[11]研究表明罗哌卡因通过下调细胞外信号调节激酶(ERK)1/2磷酸化水平对胃癌细胞的增殖具有明显的抑制作用，但对细胞的侵袭能力无明显影响；然而，罗哌卡因通过抑制Ras相关的C3肉毒素底物1/jun激酶/桩蛋白/黏着斑激酶(Rac1/JNK/paxillin/FAK)通路却具有强大的抗食管鳞癌细胞迁移作用[12]。本研究结果显示，罗哌卡因可显著抑制HeLa细胞增殖活力，随着罗哌卡因浓度的增加，其对HeLa细胞的增殖抑制作用逐渐增强。同时，罗哌卡因还可显著抑制HeLa细胞的迁移和侵袭能力，促进HeLa细胞凋亡。CDK4是在G1期中发挥重要作用，CDK4通过与Cyclin D1结合形成CDK4/Cyclin D1复合物促进细胞周期向S期推进，促进细胞过度增殖，抑制CDK4表达可抑制肿瘤发生[13]。基质金属蛋白酶2(MMP-2)可降解细胞外基质，参与细胞信号传导，在宫颈癌转移中扮演重要角色。B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)蛋白表达减少,Bcl相关X蛋白(Bax)表达增多是细胞凋亡的主要特征。本研究显示，罗哌卡因作用于HeLa细胞，能够抑制CDK4、MMP-2和Bcl2蛋白表达，促进Bax蛋白表达，与功能实验结果一致。提示罗哌卡因对HeLa细胞具有抑制增殖、迁移和侵袭，促进凋亡的作用。

PI3K/Akt途径是调控多种生物过程的重要通路，它在许多癌症中异常活跃。PI3K/Akt信号通路的激活可促进细胞周期进程，减少凋亡并促进癌细胞的迁移[14]。在宫颈癌中PI3K/Akt通路经常发生失调，抑制PI3K/Akt通路可抑制宫颈癌细胞的生长和迁移[15-16]。Zheng等[17]研究显示罗哌卡因通过抑制PI3K/Akt信号通路抑制慢性髓系白血病的生长和存活。本研究结果显示，罗哌卡因可降低HeLa细胞p-PI3K和p-Akt蛋白表达，抑制PI3K/Akt信号通路活化,推测罗哌卡因可能通过抑制PI3K/Akt通路进而在宫颈癌中发挥抗肿瘤作用。

综上，罗哌卡因可抑制宫颈癌HeLa细胞增殖、迁移、侵袭，诱导细胞凋亡，其机制可能与抑制PI3K/Akt信号通路激活有关。本研究阐明了罗哌卡因对宫颈癌细胞生物学行为的影响，为罗哌卡因在宫颈癌治疗中的应用奠定了理论基础。